Die bildgebende Massenspektrometrie ermöglicht die Untersuchung von Gewebeschnitten und damit die exakte Lokalisierung von tausenden von Proteinen in einem Experiment. Der Vorteil gegenüber bisherigen proteomischen Untersuchungen besteht darin, dass die Proteine weder markiert noch vorher bekannt sein müssen.

Mit Hilfe dieser Methode kann somit die Heterogenität von Tumoren aufgrund der unterschiedlichen Verteilung von Proteinen aber auch von Lipiden erfasst werden. Es ist zu erwarten, dass mit Hilfe dieser neuartigen Methode auch neue Tumormarker gefunden werden können.

Einleitung

Die bildgebende Massenspektrometrie, die in den letzten Jahren in den Bereichen Pharmacogenomics, Proteomics, Lipidomics, Peptidomics und Metabolomics immer populärer geworden ist [1], beschäftigt sich mit der Detektion von tausenden von Substanzen, seien es z. B. Proteine oder Lipide, deren Struktur und Molmasse vorher nicht bekannt sein muss.

In dem vorliegenden Artikel soll ein Einblick in die bildgebende Massenspektrometrie (mass spectrometric imaging, MSI) mit der Hilfe der Ionisierungsart Matrix-unterstützter Laser Desorption/Ionisation (MALDI) gegeben werden. Bei dieser Ionisierungsart wird auf die zu messende Probe eine Matrix gegeben – in den meisten Fällen handelt es sich dabei um eine organische Säure mit kleiner Molmasse – und dann z. B. ein UV-Laser auf dieses Analyt / Matrix Gemisch gerichtet (Abb. 1).

Die Matrix bildet nach Abdampfen des Lösungsmittels Kristalle, in denen die Analytmoleküle eingebettet sind. Schießt nun der Laser auf die Kristalle, wird diese Energie in Desorption und Ionisation der Proteine umgesetzt. In einem TOFAnalysator (time-of-flight) kommt es zur Trennung der Ionen auf Grund ihrer unterschiedlichen Masse und schließlich zur Detektion. In der MALDI-MSI Analyse wird anstatt einer Position ein Raster von Positionen, z. B. in einem Abstand von 100 μm in der x- und y-Achse mit dem Laser untersucht und von jeder Position ein Massenspektrum aufgenommen.

Nach der Untersuchung kann dann, z. B. in einem Bild die zweidimensionale Verteilung von Lipiden oder Proteinen innerhalb des untersuchten Gewebeschnittes dargestellt werden (Abb.

2). Dieses Bild kann, mit dem nachträglich H&E (Hämatoxylin & Eosin) gefärbten Gewebeschnitt co-registriert werden. Der Pathologe erhält so die Möglichkeit, das zu untersuchende Gewebe genau zu beurteilen.

Applikation der Matrix

Einer der wichtigsten Punkte der Probenpräparation für die bildgebende Massenspektrometrie ist die Applikation der Matrix auf das zu untersuchende Gewebe. Ursprünglich verwendete man hierfür einen DC-Sprüher (Dünnschicht- Chromatographie) [2], mittlerweile gibt es hierfür jedoch automatisierte Lösungen, wie z. B. der Imageprep (Bruker Daltonics) oder der CHIP-1000 (Shimadzu).

Die Applikation der Matrix mit Hilfe eines Inkjet-Druckers ermöglicht das punktuelle Auftragen der Matrix und verhindert damit die Delokalisation von Substanzen innerhalb des Gewebes [3].

Ein weiterer Vorteil dieser Applikationsmethode ist die Möglichkeit, mehr als eine Matrix auf das zu untersuchende Gewebe aufzubringen und somit mehrere Substanzklassen zu untersuchen, wie z. B. Proteine und Lipide auf einer Gewebeprobe (Abb. 3). Der Inkjet- Drucker kann aber auch der Evaluierung von neuen Matrixmaterialien für die bildgebende Massenspektrometrie dienen. Bei beiden Verfahren ist es das Ziel, die Auflösung von MALDIMSI von z. Zt. ca. 30 μm zu verbessern.

Untersuchung von Tumoren

Bei der Diagnostik von Tumoren ist die histomorphologische Analyse von Gewebeschnitten ein schon lange angewandtes Standardverfahren in der Pathologie. Dazu werden von gefroren oder chemisch fixierten Gewebebiopsien ca.10 μm dünne Schnitte angefertigt und mit Farbstoffen angefärbt. Damit können anatomische und histologische Eigenschaften zur Klassifizierung des Tumors analysiert werden und diese Informationen für eine Diagnose oder Therapieentscheidung genutzt werden.

Die Lokalisierung spezifischer Proteine kann mit hoher Auflösung mit Immunhistochemie (IHC) durchgeführt werden. IHC ist aber auf die Visualisierung bekannter Proteine begrenzt. Daher kann mit dieser Technik kein globaler Überblick über die vorhandenen Proteine erreicht werden. Etablierte proteomische oder genomische Verfahren, die es erlauben, eine Vielzahl oder sogar alle Gene zu analysieren, vermitteln keine Information über die räumliche Verteilung, so dass die komplexe molekulare Morphologie des Gewebes im Ergebnis nicht reflektiert wird.

Diese Einschränkung kann zu einem gewissen Maße durch Laser-basierte Gewebe- Mikrodissektion aufgehoben werden [4, 5]. Die Mikrodissektion erlaubt es, präzise definierte Gewebebereiche auszuschneiden und an diesen eine Analyse mit z. B. DNA-Arrays durchzuführen. Allerdings ist dieses Verfahren relativ aufwendig und die anschließenden Analyseverfahren müssen sehr sensitiv sein. MALDI-MSI erlaubt es dagegen, direkt von einem Gewebeschnitt molekulare Profile aufzunehmen.