Grundlagen der 2D-LC

Wenn es so richtig komplex wird

  •  Abb. 1: Grafische Darstellung der Peakkapazität anhand der mit konstanter Auflösung von R = 1 getrennten Signale, die innerhalb des Elutionszeitfensters von t0 (Durchflusszeit) bis te (Ende des Gradienten) erfasst werden. Die blaue gestrichelte Linie repräsentiert den Lösungsmittelgradienten. Abb. 1: Grafische Darstellung der Peakkapazität anhand der mit konstanter Auflösung von R = 1 getrennten Signale, die innerhalb des Elutionszeitfensters von t0 (Durchflusszeit) bis te (Ende des Gradienten) erfasst werden. Die blaue gestrichelte Linie repräsentiert den Lösungsmittelgradienten.
  •  Abb. 1: Grafische Darstellung der Peakkapazität anhand der mit konstanter Auflösung von R = 1 getrennten Signale, die innerhalb des Elutionszeitfensters von t0 (Durchflusszeit) bis te (Ende des Gradienten) erfasst werden. Die blaue gestrichelte Linie repräsentiert den Lösungsmittelgradienten.
  • Abb. 2: Experimentelle Peakkapazität (nc) in Abhängigkeit der Gradientenzeit (tG) für eine 50 x 0,3 mm Säule gepackt mit 3,0 µm vollporösen Partikeln.
  • Abb. 3: a) Prinzip der Heart-Cut 2D-LC; b) Prinzip der umfassenden 2D-LC.
  • Abb. 4: Darstellung der Abhängigkeit der Wechselwirkungsmechanismen für den Fall einer a) geringen Orthogonalität und b) hohen Orthogonalität zwischen der ersten und zweiten Trenndimension.
Thorsten Teutenberg1, Terence Hetzel1, Denise Loeker1, Juri Leonhardt1
 
Die Anforderungen an die Analytik komplexer Proben werden immer größer. Dies liegt im Wesentlichen daran, dass mit immer sensitiveren Detektoren immer geringere Konzentrationen bestimmt werden können. Darüber hinaus haben sich leistungsstarke chromatographische Verfahren etabliert, die eine Auftrennung komplexer Gemische erlauben.
 
Ein Maß für die Leistungsfähigkeit eines chromatographischen Trennsystems stellt die Peakkapazität dar. Diese gibt an, wie viele Peaks mit einer konstanten chromatographischen Auflösung R in ein Elutionszeitfenster passen. In Abbildung 1 ist dieser Sachverhalt für eindimensionale Trennverfahren grafisch dargestellt.
 
Peakkapazität
 
Das Konzept der Peakkapazität geht dabei u. a. auf eine frühe Arbeit von Grushka [1] zurück. In dieser Publikation definierte er zur Berechnung eine Auflösung von 1. Nahezu alle Werte, die in der Literatur veröffentlicht sind, beziehen sich auf diese Vorgabe. Das Elutionszeitfenster erstreckt sich dabei in der Regel von der Zeit, die eine Komponente ohne Wechselwirkung mit der stationären Phase durch das System benötigt (sog. Durchflusszeit t0) bis zu dem Zeitpunkt, an dem die letzte Komponente von der Säule eluiert. Alternativ kann zur Berechnung der theoretischen Peakkapazität auch der Endpunkt des Gradienten gewählt werden. Für die Gradientenelution wird häufig die Annahme getroffen, dass die mittlere Peakweite aller Komponenten innerhalb des Gradientenfensters konstant ist. Der Grund hierfür ist, dass durch die Bandenkompression keine Zunahme der Peakbreite mit steigender Analysenzeit erfolgt [2]. Im Gegensatz dazu wird für isokratische Trennungen beobachtet, dass die Peakbreite mit zunehmender Analysenzeit steigt. Die Peakkapazität für den Gradientenmodus kann somit anhand folgender Gleichung abgeschätzt werden:
 

 
Hierbei bedeuten nc die theoretische Peakkapazität des Systems, tG die Gradientenzeit und w̅ die mittlere Peakbreite.
 
Es stellt sich zunächst die Frage, welche Peakkapazität mit eindimensionalen chromatographischen Verfahren in der Praxis erreicht werden kann?

Wenn eine Säule mit einer Länge von 5 cm, einem Innendurchmesser von 300 µm und Partikeln mit einem Durchmesser von 3,0 µm betrachtet wird, liegt die Peakkapazität zwischen ca. 50 und 200 für eine Gradientenzeit von 1,6 bzw. 34 min, wie anhand der Auftragung in Abbildung 2 ersichtlich wird [3, 4].

 
Die maximale Gradientenzeit beträgt in diesem Fall 34 Minuten. Dabei ist anzumerken, dass eine Verdoppelung der Gradientenzeit von beispielsweise 15 auf 30 min nicht auch zu einer Verdoppelung der Peakkapazität führt (nc = 146 bei tG = 15 min, nc = 185 bei tG = 30 min). Die resultierende Kurve ist nicht linear und nähert sich mit zunehmender Gradientendauer asymptotisch einem Grenzwert. Wenn verschiedene Systeme miteinander verglichen werden sollen, ist es sinnvoll, eine Normierung einzuführen, indem die absolute Peakkapazität durch die Gradientenzeit dividiert wird. Für das o. a. Beispiel ergibt sich somit eine Peakkapazitätsproduktionsrate von 197/34 Min = 5,8 min-1
 
Die zweite Dimension
 
Der in der Literatur häufig in den Vordergrund gestellte Vorteil von zweidimensionalen Trennverfahren im Vergleich zu eindimensionalen Trennsystemen wird in der deutlich höheren Peakkapazität > 1.000 gesehen [5]. Diese Aussage basiert auf dem Konzept der umfassenden zweidimensionalen Chromatographie (LC x LC) und der Annahme, dass ein orthogonales Trennsystem vorliegt. Bei der umfassenden 2D-LC wird in der Regel das komplette Chromatogramm der ersten Trenndimension fraktioniert auf eine zweite Trennsäule übertragen. Dieser Vorgang wird durch das Adjektiv „umfassend“ charakterisiert. In diesem Fall ist das Zeichen für die Multiplikation „x“ zu verwenden. Der Chromatogramm-Ausschnitt in Abbildung 3 b verdeutlicht diesen Sachverhalt.
 
Orthogonal
 
Orthogonalität bedeutet in diesem Kontext, dass die Trennmechanismen in beiden Dimensionen unabhängig voneinander sind, also in der ersten Dimension bspw. eine Trennung nach Hydrophobizität und in der zweiten Dimension nach Größe erfolgt. Im Optimalfall verteilen sich die in der Probe befindlichen Analyten gleichmäßig über die zweidimensionale chromatographische Fläche. Dieser Fall entspricht dem in Abbildung 4 b dargestellten Szenario. Die Punkte repräsentieren die Peakmaxima der getrennten Substanzen in der ersten und zweiten Dimension. Es ist zu erkennen, dass sich die Peaks über die zur Verfügung stehende chromatographische Fläche verteilen. Im Gegensatz dazu ordnen sich die in Abbildung 4 a dargestellten Punkte entlang der Winkelhalbierenden an. Es wird somit nur ein sehr kleinen Teil der insgesamt zur Verfügung stehenden Fläche ausgefüllt was bedeutet, dass sich die Trennmechanismen beider Dimensionen nicht sehr stark voneinander unterscheiden. Solche orthogonalen Trennsysteme sind für praktische Anwendungen nur sehr schwierig zu finden. Eine Ausnahme bildet die Polymeranalytik, bei der die gerade genannten Wechselwirkungsmechanismen in vielen Fällen unabhängig voneinander sind [6]. Für den Bereich der Proteomanalytik hat sich demgegenüber eine Kombination aus der Ionenaustausch-Chromatographie mit der Umkehrphasen-Chromatographie als besonders vorteilhaft erwiesen [7]. Wird Orthogonalität vorausgesetzt, verhalten sich die Peakkapazitäten beider Trenndimensionen zueinander multiplikativ, wie anhand von Gleichung 2 nachvollzogen werden kann:
 

 
Optimieren
 
Um eine zweidimensionale Trennung zu optimieren, müssen also sowohl die Gesamteffizienz über die Peakkapazität als auch die Selektivität der ausgewählten Trennsysteme betrachtet werden. Dies bedeutet, dass auch bei zweidimensionalen Trennsystemen die Selektivität niemals außer Acht gelassen werden darf. Für praktische Anwendungen müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, die zu einer deutlichen Verringerung der tatsächlichen Peakkapazität führen. Eine ausführliche Diskussion würde an dieser Stelle zu weit führen, jedoch sollte der Leser sich darüber bewusst sein, dass die in vielen Publikationen angegebenen Werte für die Peakkapazität zweidimensionaler Systeme mit äußerster Vorsicht zu genießen sind [8]. Der Anwender ist aus praktischer Sicht eher an der Frage interessiert, ob mit Hilfe eines zweidimensionalen Ansatzes auch tatsächlich mehr Komponenten des Gemisches aufgetrennt und detektiert werden können. Diese Frage ist niemals pauschal zu beantworten, sondern hängt immer auch von der konkreten analytischen Fragestellung bzw. Probe ab, die es zu untersuchen gilt. Um wirklich zu entscheiden, ob ein eindimensionales oder zweidimensionales Trennsystem besser geeignet ist, müssten die Experimente auf beiden Systemen durchgeführt und die Resultate verglichen werden [9, 10].
 
Heart-Cut
 
Eine Alternative zur umfassenden zweidimensionalen LC x LC ist die Heart-Cut-Technik (LC - LC). Hierbei werden, wie in Abbildung 3 a dargestellt, lediglich eine oder wenige Fraktionen aus dem Chromatogramm der ersten Trenndimension geschnitten und auf eine zweite Säule überführt. Dieser Ansatz eignet sich immer dann, wenn z. B. die Reinheit eines einzelnen Peaks genauer untersucht werden soll [11]. In diesem Fall kommt es weniger auf die Gesamtpeakkapazität des zweidimensionalen Trennsystems an, als auf die „geschickte“ Kombination von Trennsäulen, die sich in ihrer Selektivität deutlich voneinander unterscheiden. Eine Kombination aus einer Umkehrphase mit einer Normalphase oder HILIC-Phase sollte per Definition sehr gut geeignet sein, wenn die Probe sowohl sehr polare als auch unpolare Verbindungen enthält [12]. Allerdings wird in der Praxis häufig beobachtet, dass eine HILIC-Trennung zu keiner oder nur unzureichenden Auftrennung führt, wenn die in der Probe enthaltenen Komponenten auf einer Umkehrphase eine ausreichende Retention erfahren [13]. Vor diesem Hintergrund kann es sinnvoll sein, zwei RP-Systeme miteinander zu kombinieren, und den erforderlichen Unterschied in der Selektivität durch Variation des pH-Wertes, der Temperatur, dem organischen Co-Solvenz sowie der Gradientensteigung zu erhalten [14].
 
Fazit und Ausblick
 
Die umfassende zweidimensionale Chromatographie wird sich vermutlich in all denjenigen Bereichen etablieren, in denen extrem komplexe Proben analysiert werden müssen. Dies betrifft die Umweltanalytik, die Lebensmittelanalytik und insbesondere die Bioanalytik [15]. Da sich eine Quantifizierung einzelner Verbindungen aus einem LC x LC-Analysenlauf bislang immer noch sehr schwierig gestaltet, ist diese Variante der zweidimensionalen Chromatographie zunächst für Screeninganalysen geeignet. Methoden, die eine Quantifizierung einzelner Targetverbindungen erforderlich machen, werden demgegenüber über den Heart-Cut Ansatz oder eindimensionale Verfahren erfolgen. Um die tatsächliche Leistungsfähigkeit zweidimensionaler Trennverfahren anhand realer Applikationen bewerten zu können, wäre ein Vergleich zwischen ein- und zweidimensionalen Trennmethoden anhand eines breit angelegten Ringversuchs zwingend erforderlich. Neben der Optimierung der Peakkapazität spielt auch die Auswahl der Trennsysteme in beiden Dimensionen, die über einen großen Selektivitätsunterschied bzw. eine hohe Orthogonalität verfügen sollten, eine entscheidende Rolle.
 
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Zugehörigkeiten
1Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA), Duisburg
 
Kontakt
Dr. Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Bereichsleiter Forschungsanalytik
Duisburg
 
Fortschrittliche Chromatographie: http://www.git-labor.de/fortschrittliche-chromatographie
 
Mehr Informationen: http://www.git-labor.de/search/gitsearch/Chromatographie%20type:topstories
 
Chemgapedia-Lerneinheit(en) zum Thema: http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/16/ac/hplc/2d_hplc/2d_hplc.vlu.html
 

Literatur:

[1]        Grushka, E., Chromatographic peak capacity and the factors influencing it. Analytical Chemistry, 1970, 42(11), 1142-1147; DOI:10.1021/ac60293a001

[2]        Schellinger, A. P., Carr, P. W., Isocratic and gradient elution chromatography: A comparison in terms of speed, retention reproducibility and quantitation. Journal of Chromatography A, 2006, 1109, 253-266; DOI:10.1016/j.chroma.2006.01.047

[3]        Neue, U., Theory of peak capacity in gradient elution. Journal of Chromatography A, 2005, 1079 (1-2), 153-161

[4]        Hetzel, T., Blaesing, C., Jaeger, M., Teutenberg, T., Schmidt, T.C., Characterization of peak capacity of microbore liquid chromatography columns using gradient kinetic plots, Journal of Chromatography A, 2017, 1485, 62-69; DOI:10.1016/j.chroma.2005.03.008

[5]        Stoll, D. R., Wang, X., Carr P. W., Comparison of the Practical Resolving Power of One- and Two-Dimensional High-Performance Liquid Chromatography Analysis of Metabolomic Samples. Analytical Chemistry, 2008, 80 (1), 268-278

[6]        Kilz, P., Radke, W., Application of two-dimensional chromatography to the characterization of macromolecules and biomacromolecules. Analytical & Bioanalytical Chemitsry, 2015, 407, 193-21; DOI:10.1007/s00216-014-8266-x

[7]        Donato, P., Cacciola, F., Mondello, L., Dugo, P., Comprehensive chromatographic separations in proteomics. Journal of Chromatography A, 2011, 1218 (49), 8777-8790

[8]        Li, X., Stoll, D. R., Carr, P. W., A Simple and Accurate Equation for Peak Capacity Estimation in Two Dimensional Liquid Chromatography. Analytical Chemistry, 2009, 81 (2), 845-850; DOI:10.1016/j.chroma.2011.05.070

[9]        Teutenberg, T., Leonhardt, J. Peak versus Peak capacity – The role of comprehensive two-dimensional liquid chromatography. GIT separation 2/2014, 20 – 21, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, GIT VERLAG, Weinheim

[10]      Leonhardt, J., Teutenberg, T., Türk, J., Schlüsener, M. P., Ternes, T. A., Schmidt, T. C., A comparison of one-dimensional and microscale two-dimensional liquid chromatographic approaches coupled to high resolution mass spectrometry for the analysis of complex samples. Analytical Methods, 2015, 7 (18), 7697-7706; DOI:10.1039/C5AY01143D

[11]      Lee, C., Zang, J., Cuff, J., McGachy, N., Natishan, T. K., Welch, C. J., Helmy, R., Bernardoni, F., Application of Heart-Cutting 2D-LC for the Determination of Peak Purity for a Chiral Pharmaceutical Compound by HPLC. Chromatographia, 2013, 76 (1), 5-11; DOI:10.1007/s10337-012-2367-5

[12]      Francois, I., Sandra, K., Sandra, P., Comprehensive liquid chromatography: Fundamental aspects and practical considerations - A review. Analytica Chimica Acta, 2009, 641(1-2), 14-31; DOI:10.1016/j.aca.2009.03.041

[13]      Leonhardt, J., Teutenberg, T., Buschmann, G., Gassner, O., Schmidt T. C., A new method for the determination of peak distribution across a two-dimensional separation space for the identification of optimal column combinations. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2016, 408 (28), 8079-8088; DOI:10.1007/s00216-016-9911-3

[14]      Pursch, M., Lewer, P., Buckenmaier, S., Resolving Co-Elution Problems of Components in Complex Mixtures by Multiple Heart-Cutting 2D-LC. Chromatographia, 2017, 80 (1), 31-38; DOI:10.1007/s10337-016-3214-x

[15]      Fumes, B. H., Andrade, M. A., Franco, M. S., Lancas, F. M., On-line approaches for the determination of residues and contaminants in complex samples. Journal of Separation Science, 2017, 40(1), 183-202

 

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