HPLC-Pumpen: Split oder Splitless?

Der Einfluss von Pumpentechnologie auf die Effizienz der HPLC

  • Abb. 1: Auftragung der Gradientenverweilzeit (Zeit) vom Punkt der Mischung der Lösungsmittel bis zum Säulenkopf in Abhängigkeit des Verweilvolumens und der Flussrate.Abb. 1: Auftragung der Gradientenverweilzeit (Zeit) vom Punkt der Mischung der Lösungsmittel bis zum Säulenkopf in Abhängigkeit des Verweilvolumens und der Flussrate.
  • Abb. 1: Auftragung der Gradientenverweilzeit (Zeit) vom Punkt der Mischung der Lösungsmittel bis zum Säulenkopf in Abhängigkeit des Verweilvolumens und der Flussrate.
  • Abb. 2: Analyse von 30 Pharmaka und Personal Care Produkten auf einer YMC Triart C18-Säule (50 x 0,3 mm, 1,9 µm) mit einer Gradientenlaufzeit von 12 s. Flussrate: 50 µL min-1, Temperatur: 70 °C, Detektion: Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. © Terence Hetzel
  • Abb. 3: Overlay aus 100 aufeinander folgenden Gradientenmessungen. Dargestellt ist jeder zehnte Gradient.

Die Entwicklungen im Bereich stationärer Phasen haben es notwendig gemacht, dass die vorhandene Hardware von HPLC-Systemen neu konzipiert werden musste. Insbesondere die Einführung der sub-2 µm Partikel erforderte, den Druckbereich anzuheben und kritische System- und Totvolumina zu minimieren.

Vor diesem Hintergrund ist die Effizienzsteigerung durch die Nutzung kleiner Partikel der stationären Phase in entscheidendem Maße von der Pumpentechnologie abhängig, was wir im weiteren Verlauf diskutieren möchten.

Split oder Splitless

Ein immer wieder zitierter Vorteil miniaturisierter Trennverfahren ist die Einsparung teurer und toxischer Lösungsmittel. Wird anstelle einer Trennsäule mit einem Innendurchmesser (ID) von 3,0 mm eine Säule mit einem ID von 300 µm verwendet, so reduziert sich der absolute Lösungsmittelverbrauch bei gegebener linearer Fließgeschwindigkeit um den Faktor 100. Dieser Vorteil kommt aber nur dann in vollem Umfang zur Geltung, wenn ein Pumpensystem ohne Fluss-Splitter verwendet wird. Nicht alle Systeme, die als Nano- oder Mikro-LC-Systeme genutzt werden können, sind in der Lage, einen echten Nano- oder Mikroliterfluss zu generieren. Dies bedeutet, dass der Fluss vor der Trennsäule geteilt wird und dass somit faktisch keine Einsparung von Lösungsmitteln möglich ist. Vor diesem Hintergrund hat es in den letzten Jahren vermehrt Entwicklungen gegeben, pneumatische Spritzenpumpen zu verwenden. Ein weiterer Vorteil dieser Systeme ist, dass in den meisten Fällen auf großvolumige Mischkammern verzichtet werden kann, sodass ein extrem geringes Gradientenverweilvolumen resultiert. Diesen Sachverhalt möchten wir anhand von Abbildung 1 veranschaulichen. Auf der y-Achse ist die Zeit aufgetragen, die vom Punkt der Mischung der Lösungsmittel bis zum Erreichen des Säulenkopfes benötigt wird. Auf der x-Achse ist die absolute Flussrate aufgetragen. Wird z. B. ein UHPLC-System mit einem Gradientenverweilvolumen von lediglich 50 µL verwendet (rote Linie in Abbildung 1) und beträgt die Flussrate 50 µL min-1, so resultiert eine Verzögerungszeit von einer Minute, bis der Gradient die Säule erreicht. Diese Zeit muss auch berücksichtigt werden, wenn die Säule nach Ende des Gradienten wieder re-äquilibriert wird. Ein Gradientenverweilvolumen von lediglich 50 µL ist auch für moderne UHPLC-Systeme sehr gering, in vielen Fällen ist dieses deutlich größer (z. B. 200 µL). Dies bedeutet, dass sich die Verweilzeit deutlich erhöht.

So geht es schnell

Auch wenn es aufgrund der technischen Spezifikationen möglich ist, moderne UHPLC-Systeme auch für den Mikro-LC-Bereich einzusetzen, spielt das Verweilvolumen eine entscheidende Rolle hinsichtlich der Gesamtanalysenzeit. Beträgt das Gradientenverweilvolumen lediglich 1 µL, wie dies bei modernen Nano- bzw. Mikro-LC-Systemen der Fall ist, so reduziert sich die Verweilzeit auf gerade einmal 1,2 Sekunden. Mit solchen Systemen können somit sehr schnelle Gradientenlaufzeiten und Gesamtzykluszeiten realisiert werden, wie anhand der Trennung ausgewählter Pharmazeutika in Abbildung 2 gezeigt wird. Für die Detektion wurde ein Massenspektrometer mit einer sehr schnellen Datenaufnahmerate verwendet.

Das Elutionszeitfenster für die Trennung aller Komponenten erstreckt sich dabei nur über wenige Sekunden, die Gradientenzeit beträgt in diesem Fall lediglich 12 Sekunden. Eine solch schnelle Trennung kann unter Verwendung von sub-2 µm Partikeln und des Drucklimits der Trennsäule von 600 bar nur bei erhöhter Temperatur (70°C) realisiert werden. Die lineare Fließgeschwindigkeit bei einer absoluten Flussrate von 50 µL min-1 errechnet sich unter Annahme einer Systemdurchflusszeit von 2,9 Sekunden zu 1,7 cm s-1. Bei Nutzung einer Trennsäule mit einem ID von 2,1 mm ergäbe sich bei gleicher linearer Fließgeschwindigkeit eine absolute Flussrate von 2,45 mL min-1. Solch hohe Flussraten liegen deutlich über dem optimalen Bereich für die Kopplung mit der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS).

Anwendungen

Es stellt sich die Frage, für welche Anwendungen derart schnelle Trennungen benötigt werden? Abgesehen vom Hochdurchsatz-Screening mit mehreren Hundert oder Tausend Proben pro Tag lässt sich diese Technologie auch im Bereich der Prozessanalytik einsetzen, um z. B. in Echtzeit Daten über die Zusammensetzung eines Reaktionsgemisches zu erhalten und Prozesse sowie chemische Reaktionen unmittelbar zu steuern bzw. zu überwachen. Der Vorteil der Miniaturisierung ist, dass das benötigte Probevolumen im Grenzfall bis auf wenige Nanoliter reduziert werden kann. Dies ist für alle Prozesse, die eine minimalinvasive Analytik voraussetzen, von entscheidendem Vorteil. Darüber hinaus bieten schnelle Gradiententrennungen für die umfassende zweidimensionale HPLC (sog. LC x LC) den Vorteil, schnelle Zykluszeiten von 30 Sekunden zu realisieren.

Robust

Ein hartnäckiges Vorurteil gegenüber miniaturisieren Pumpensystemen ist nach wie vor die fehlende Robustheit. Dass es sich hierbei tatsächlich nur um ein Vorurteil handelt, möchten wir wie folgt belegen.
Abbildung 3 zeigt ein Overlay aus 100 aufeinander folgenden Gradientenmessungen, wobei aus Gründen der Übersichtlichkeit nur jede zehnte Einzelmessung dargestellt ist. Anhand dieser Grafik können gleich mehrere wesentliche Fragen beantwortet werden. Zum einen ist ersichtlich, dass es praktisch keine Abweichungen im Ansprechverhalten des Gradienten gibt. Das Gradientenverweilvolumen wurde zu 0,93 µL bestimmt. Zum anderen kann die Hauptsorge vieler Anwender, dass ein reproduzierbarer Betrieb von Mikro-LC-Systemen nicht gegeben ist, eindeutig widerlegt werden. In diesem Zusammenhang haben Hetzel et al. kürzlich eine Methode zur Trennung und Detektion wichtiger Zytostatika mittels Mikro-LC-MS/MS Kopplung validiert (Hetzel et al., Anal Bioanal Chem 408 (2016), 8221-8229). Die Ergebnisse belegen, dass die Mikro-LC-MS/MS Kopplung die Vorgaben in Bezug auf die Robustheit in einem Routinelabor erfüllt.

Autoren
T. Teutenberg1, T. Hetzel1, D. Loeker1, J. Leonhardt1

Zugehörigkeit
1Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA), Duisburg, Deutschland

Kontakt 
Dr. Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und
Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Bereichsleiter Forschungsanalytik
Duisburg, Deutschland
teutenberg@iuta.de

 

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