Die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) [1,2] ist eine alternative HPLC-Technik, die auf einer Kombination von polaren stationären Phasen und wässrigen/organischen mobilen Phasen basiert und hauptsächlich für die Trennung von stark polaren Verbindungen wie Aminosäuren, Glycopeptiden, Oligonucleotiden und hochgradig polaren Naturstoffen verwendet wird [3].

Kürzlich wurde die kovalente Immobilisierung von Kohlenhydraten auf Feststoffträgern mittels kupferkatalysierter Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) [4] entwickelt, was mit dem nachgewiesenen Potential dieser Reaktion bei Oberflächenmodifizierungen [5] im Einklang steht. Bei den „Click-Sacchariden" [6], die für HILIC-Anwendungen unter Verwendung des Click-Chemie-Ansatzes hergestellt wurden, wurden die in zwei Schritten azido-modifizierten Silikagele in Gegenwart eines Kupferkatalysators an Zuckeralkine gekoppelt, um die obigen Füllmaterialien zu erhalten, wobei die gebundenen Kohlenhydrate ihre natürliche Konfiguration und ihre Eigenschaften beibehalten.

Synthese der stationären Phase auf Zuckerbasis
Wir berichteten [7] kürzlich über die Herstellung eines neuen Silikagels auf Zuckerbasis unter Verwendung der CuAAC-Reaktionen von Propargyl-O-Lactosid, einem Zuckeralkin, mit einem neuen azido-aktivierten Silikagel unter Bildung einer vollständig charakterisierten stationären Phase (Schema 1), die für die Trennung von Monosacchariden mittels HILIC und dynamischer HILIC (DHILIC) geeignet ist. Eine entscheidende Besonderheit des Aktivierungsprozesses besteht in der Einführung von azido-terminierten Gruppen auf der Kieselsäureoberfläche in einem einzigen Schritt, durch eine Dipropylethergruppe auf Abstand gehalten, und der gleichzeitigen Bildung einer Hydroxygruppe. Die Reaktionen wurden mittels FT-IR-Spektroskopie, Elementaranalyse und Differential-Scan-Kalorimetrie (DSC) überwacht.
Über den von uns entwickelten Syntheseweg (Azido-Aktivierung der Kieselsäure in einem statt in zwei Schritten) ist das Material auf Zuckerbasis schneller und leichter zugänglich und die erhaltene Matrix ist hydrophiler. Mit diesem Material wurde unter Verwendung des schon beschriebenen [8] Packverfahrens eine rostfreie Stahlsäule (150 mm × 4,1 mm Innendurchmesser) gepackt.

HILIC-Verhalten
Um die Trennfähigkeit des Silikagels auf Zuckerbasis bei der HILIC-Methode zu untersuchen, wurden chromatographische Untersuchungen mit polaren Analyten als Messproben durchgeführt.

Es wurde ein Vergleich zu einer aminopropyl-gebundenen Kieselsäure-Säule (APS) angestellt, welche als erste gebundene stationäre Phase für die routinemäßige Trennung von Kohlenhydraten mit der HILIC-Methode verwendet wurde. In die vergleichende Untersuchung wurde eine mit einem diol-modifizierten Silikagel gepackte Säule (DIOL) einbezogen. Dies ist aufgrund der hohen Polarität und der Wasserstoffbindungseigenschaften eine nahezu ideale Phase für HILIC-Anwendungen. Die Untersuchung der Retentionsdaten für polare Testverbindungen (Uracil, Adenosin, Cytosin) und Naphthalen unter Phasenumkehr- Bedingungen (RP) ergab dieselbe Elutionsreihenfolge bei dem hergestellten Zucker-Silikagel wie bei den typischen HILIC-Säulen: Naphthalen wurde mit der Front eluiert (k = 0) und immer vor dem Uracil, welches in der RP-HPLC ein gängiger Totzeitmarker ist.

HILIC-Anwendungen
Wir begannen unsere Untersuchung mit der Analyse von zwei azyklischen Zucker-Polyolen, d-Arabitol und d-Mannitol, bei Raumtemperatur. Es ergaben sich aufgrund ihres nichtreduzierenden Verhaltens einzelne scharfe Peaks [mobile Phase: Acetonitril/Wasser (85:15 v/v); Verdampfungs-Lichtstreudetektion (ELSD)]. Als wir anschließend reduzierende Monosaccharide analysierten (drei Aldopentosen, fünf Aldohexosen, einschließlich zweier Deoxy-Zuckern und einer Ketohexose), beobachteten wir verschiedene, veränderte Peakformdeformen, ein Hinweis auf aktive Interkonversionsprozesse zwischen zwei anomeren Peaks während ihrer chromatographischen Trennung (Mutarotation). Da gezeigt worden ist, dass für eine vollständige HPLC-Trennung von Zuckeranomeren sehr geringe Säulentemperaturen notwendig sind [9], führten wir Cryo-HPLC-Trennungen der Modellkohlenhydrate durch (T = -5 °C) und erhielten Grund­linienauflösungen für alle Pyranose-Isomere, ­obwohl die typischen Säulentemperaturen zwischen ~60 und ~25 °C liegen sollten, um eine Grundlinienauflösung der Zuckeranomere zu erhalten [9]. Wir fanden heraus, dass die Aldohexosen die am längsten zurückgehaltenen Monosaccharide waren, wobei die Epimere einen erheblichen Unterschied aufwiesen (d.h. Galactose, Mannose und Glucose). Die Aldopentosen wurden viel weniger zurückgehalten, die drei Epimere zeigten leichte Unterschiede in der Retention (Ribose, Arabinose und Xylose). Fucose (6‑Deoxygalactose) war der Zucker, der von der ganzen Serie am wenigsten zurückgehalten wurde und zeigte eine verkürzte Retentionszeit in Bezug auf den entsprechenden nativen Zucker (Galactose), in Übereinstimmung mit dem ermittelten HILIC-Retentionsverhalten von Cyclodextrinphasen, wo die Retention mit der Anzahl der verfügbaren Hydroxylgruppen im Saccharid zunimmt [10]. Außerdem wiesen Fucose, Fructose, Galactose und Arabinose sowohl Pyranose- als auch Franoseanomere auf, wie schon berichtet wurde [9]. Dies ist jedoch das erste Mal, dass alle ineinander umwandelbaren Anomere in einem einzigen Chromatographielauf aufgelöst wurden, wobei insgesamt vier Peaks erhalten wurden. Über die HILIC-Trennung von d-Fructose mit variabler Temperatur (Abb. 1) waren alle vier Anomere (zwei Pyranosen und zwei Furanosen) leicht zugänglich, wohingegen die beiden Furanose-Isomere dieses Zuckers früher nur als nicht-aufgelöstes Gemisch detektiert worden sind [9].