ICP-MS Analytik

Die Vorbereitung biologischer Proben

  • Tab. 1: Gemittelte Ergebnisse für Vollblut 3 nach Vorbereitungsmethode 1, 2 und 3Tab. 1: Gemittelte Ergebnisse für Vollblut 3 nach Vorbereitungsmethode 1, 2 und 3
Andrew Ryan
 
Im Verlauf der vergangenen 20 Jahre hat sich in der klinischen Analytik von biologischen Materialien ein schrittweiser Übergang von der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) zur Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) vollzogen.
 
Sowohl die Flammen- als auch die Graphitrohr-AAS haben sich über lange Zeit in Krankenhäusern, klinischen Instituten, Universitäten, Gesundheitsorganisationen und Laboren zur Forschung und Überwachung etabliert. Die Stärke der Atomabsorption liegt in der Fähigkeit Haupt- und Spurenelemente sowie essentielle und toxische Elemente in verschiedenen biologischen Proben vom %-Bereich bis in den untersten ppb-(<1ppb) Bereich richtig und präzise zu bestimmen.
 
ICP-MS und AAS
 
Dennoch hat sich die ICP-MS mit ihrer Fähigkeit, mehr Elemente in kürzerer Zeit zu messen, in der Elementanalytik in der klinischen Industrie durchgesetzt. Mit einem großen dynamischen Bereich und niedrigen Nachweisgrenzen ist die ICP-MS in der Lage den steigenden Anspruch nach mehr Information in kürzerer Zeit zu erfüllen. 
 
Die Ablösung der Flammen- und Graphitrohr-AAS durch die ICP-MS führt zu einer deutlich heißeren Anregungsquelle für die Zersetzung der Proben in ihre individuellen Atome (und Ionen). Dies führt zu geringeren Matrixeffekten und ermöglicht eine Multielementanalytik. Während die Graphitrohr-AAS Vorteile bei geringeren Probenvolumina im Mikroliter Bereich aufweist, ermöglicht die ICP-MS niedrigere Nachweisgrenzen bei einer höheren Verdünnung der Proben.
 
Probenvorbereitung
 
Doch bevor Proben analysiert werden können, müssen sie vorbereitet werden. Die einfachste Möglichkeit ist die direkte Analyse. Die Matrix biologischer Proben übersteigt jedoch meist die für ICP-MS zulässige Höchstgrenze gelöster Feststoffe für Routine- und Langzeitmessungen. Darüber hinaus müssen auch die verschiedenen Matrizes von biologischen Proben berücksichtigt werden, um die Richtigkeit der Ergebnisse sicherzustellen, denn z.B.

der pH-Wert einer zu analysierenden Probe kann entscheidend dafür sein, welche Elemente präzise gemessen werden können. Daher stellt sich oft die Frage nach dem besten Weg biologische Proben für die Analyse mittels ICP-MS vorzubereiten.

 
Biologische Proben haben von Natur aus einen hohen Anteil an Salzen und organischen Substanzen, wie Zellen, Proteine, Koagulate, Zellflüssigkeit und Chlor-basierte Salze, hauptsächlich in Verbindung mit Natrium. Die elementare Zusammensetzung dieser Komponenten variiert ebenso wie deren Form. 
 
Einige Elemente liegen anorganisch und leicht extrahierbar vor, während andere organisch gebunden oder von Zellstrukturen umschlossen sind und damit aggressivere Extraktionen bis hin zu Säureaufschlüssen erfordern, um die organischen Verbindungen zu zersetzen und komplett zu entfernen.
 
Vergleich
 
Dieser Artikel vergleicht drei Techniken zur Vorbereitung biologischer Proben für die Analyse, mit Schwerpunkt auf Vollblut. Andere Matrizes wie Urin, Blutplasma und Serum wurden ebenfalls untersucht. Vollblut ist jedoch die anspruchsvollste Matrix in Hinblick auf die Probenvorbereitung und Analyse mit ICP-MS. Es wurde eine Vielzahl an Plasma-, Serum-, Urin- und Vollblut-Kontrollstandards vorbereitet und die Konzentrationen verschiedenster Elemente jeder Matrix bezogen auf eine gemeinsame externe Kalibration bestimmt. Die evaluierten Methoden zur Probenvorbereitung umfassten:
 
1. Vollständiger mikrowellenunterstützter Säureaufschluss mit geschlossenen Gefäßen
2. Saure Verdünnung in 0,5 % HNO3, 1 % Propanol, 0.1 % Triton X-100 und 200 ppb Au
3. Alkalische Verdünnung in 2 % NH4OH, 2g/L EDTA, 1 % Propanol, 0.05 % Triton X-100 und 200 ppb Au
 
Methode 1 ermöglicht eine vollständige Zersetzung der organischen Bestandteile und stellt wohl die universellste Methode zur Vorbereitung biologischer Proben dar. Geschlossene Gefäße bei einem Mikrowellenaufschluss verringern den Verlust leichtflüchtiger Elemente, erhöhen aber das Risiko für Verunreinigungen durch erhöhtes Probenhandling. Der größte Nachteil des Mikrowellenaufschlusses ist der Zeitfaktor. Offene Aufschlusssysteme können eine größere Anzahl von Proben einfacher verarbeiten, bergen jedoch das Risiko des Verlustes flüchtiger Elemente wie Hg, As oder Se. 
 
Methode 2 erscheint auf den ersten Blick durch die Vielzahl der benötigten Reagenzien sehr komplex, erfordert jedoch lediglich eine Verdünnung der Proben mit der zuvor in einem größeren Volumen hergestellten Verdünnungslösung. Dabei sind hochreine Reagenzien wichtig um Verunreinigungen auf ein Minimum zu beschränken. Die Zugabe von Salpetersäure führt zur Gerinnung von Proteinen und stabilisiert die Elemente. Sie wird jedoch auf ein Minimum beschränkt, da geronnenes Material potenziell den Zerstäuber des ICP-MS-Probenzufuhrsystems verstopfen kann. Die Zugabe von Triton X-100 als oberflächenaktive Substanz trägt zur Auflösung der Zellmembranen bei und erhält die Homogenität der Probe. 
 
Kohlenstoff
 
Zahlreiche Veröffentlichungen behandeln den Einfluss von Kohlenstoff auf die Ionisierungseffizienz von schwer ionisierbaren Elementen, darunter auch wichtige klinische Elemente wie Arsen und Selen. Da der Kohlenstoffanteil in biologischen Materialien stark mit der Matrix variiert, verändert sich ebenso der Ionisierungsgrad dieser beiden Elemente im Plasma und damit die resultierenden Signalintensitäten. Daher wird ein mischbares, organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Propanol zugefügt, um den Effekt durch Sättigung aller zu messenden Lösungen zu puffern. 
 
Um den Verschleppungseffekt von Quecksilber zu verringern und die Ausspülzeiten zu optimieren wird zusätzlich Gold mit etwa 200 ppb zugegeben. 
 
Bei Vollblutproben, verdünnt in dieser sauren Matrix, lagern sich rote Blutzellen und Koagulate am Boden der Probenröhrchen ab. Platziert man die Röhrchen in einem Ultraschallbad, können diese zu einem gewissen Anteil aufgelöst werden. Für die Analyse sollte der partikuläre Anteil vermieden werden, da dieser leicht den Zerstäuber verstopfen kann.
 
Methode 3 verwendet Ammoniumhydroxid und erzeugt damit eine alkalische Lösung welche die Gerinnung des biologischen Materials verhindert. EDTA wird als Komplexbildner hinzugefügt, um die zu untersuchenden Elemente zu stabilisieren. Propanol, Triton x-100 und 200 ppb Au werden aus den oben bereits genannten Gründen hinzugefügt. Die alkalische Matrix ermöglicht außerdem die Analyse von Iod, da das Element stabilisiert und Verschleppungseffekte minimiert werden. 
 
Analyse von Vollblut
 
Eine Vielzahl biologischer Kontrollstandards für Urin, Plasma, Serum und Vollblut wurde mit den drei Vorbereitungsmethoden präpariert und mittels ICP-MS analysiert.
 
Die Bildung spektroskopischer Interferenzen aus Matrixbestandteilen biologischer Proben stellt eine weitere Herausforderung bei der Analyse mit ICP-MS dar. Diese Interferenzen überlagern Isotope wichtiger Analytelemente, welche typischerweise in der ICP-MS verwendet werden. Glücklicherweise verfügen die meisten modernen ICP-MS-Instrumente über Kollisions-Reaktionsgassysteme, welche Interferenzen effektiv beseitigen und damit die Nachweisgrenzen bis in den ppt-(parts-per-trillion) Bereich verbessern. 
 
Der Vollblut Kontrollstandard (Clincheck, Recipe Chemicals), wurde unabhängig voneinander nach den drei Methoden vorbereitet und an drei Stellen unabhängig voneinander auf baugleichen Geräten analysiert (Plasmaquant MS, Analytik Jena). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Verdünnungsmethoden 2 und 3 enthalten eine 20-fache Verdünnung, während der finale Verdünnungsfaktor nach Säureaufschluss mit Methode 1 Faktor 100 betrug. 
 
Ergebnisse
 
Mit allen drei Methoden wurde eine sehr gute Wiederfindung erreicht. Die Werte liegen für die meisten Elemente im Mittel des zertifizierten Bereiches. Ausnahmen sind für Cu und Zn für den Säureaufschluss zu beobachten. Hier liegen die Ergebnisse am unteren Ende des Bereiches, während die Ergebnisse für die alkalische Verdünnung im mittleren bis oberen Bereich und näher am Mittelwert liegen.
 
Schlussfolgerung
 
Die Studie hat drei Probenvorbereitungsmethoden für die Analyse biologischer Proben mittels ICP-MS gegenübergestellt. Alle drei Methoden eignen sich für die Bestimmung wichtiger Elemente in biologischen Proben. Mögliche Ausnahmen stellen Cu und Zn dar. Im Vergleich zur sauren Verdünnung weist die alkalische Verdünnung hierfür bessere Wiederfindungsraten auf. Diese Elemente könnten teilweise im geronnenen Material gebunden sein, welches im sauren Medium noch vorhanden ist. Dies konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, da diese Elemente nicht nach vollständigem Säureaufschluss untersucht wurden. Andere Veröffentlichungen zeigen eine gute Wiederfindung für Cu und Zn nach vollständigem Säureaufschluss und alkalischer Verdünnung.
 
Die Literatur zu diesem Beitrag finden Sie für den Einfachen Zugriff auf die Originalquelle unter:http://www.git-labor.de/forschung/chemie-physik/icp-ms-analytik
 
Kontakt 
Andrew Ryan
Analytik Jena AG
Jena 
 
Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/search/gitsearch/ICP-MS%20type:topstories
 

Referenz

[1] Alkali dilution of blood samples for high throughput ICP-MS analysis – comparison with acid digestion. Ying Lu, Maria Kippler, Florencia Harari, Margaretha Grandér, Brita Palm, Helena Nordqvist, Marie Vahter. Clinical Biochemistry 48 (2015) 140-147. DOI:10.1016/j.clinbiochem.2014.12.003

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