Identifizierung von isomeren Kohlenhydraten

Analyse von Glycanen mittels Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie

  • Abb. 1: Arten der Isomerie in komplexen Oligosacchariden. Alle drei Isomerien führen zu Molekülen mit identischer atomarer Zusammensetzung und Masse.Abb. 1: Arten der Isomerie in komplexen Oligosacchariden. Alle drei Isomerien führen zu Molekülen mit identischer atomarer Zusammensetzung und Masse.
  • Abb. 1: Arten der Isomerie in komplexen Oligosacchariden. Alle drei Isomerien führen zu Molekülen mit identischer atomarer Zusammensetzung und Masse.
  • Abb. 2: Prinzip einer Ionenmobilitäts-Trennung. Analytionen werden nicht nur nach ihrer Masse und Ladung, sondern auch nach ihrer Größe und Form getrennt, wodurch Isomere unterschieden werden können.
  • Abb. 3: Analyse von isomeren Oligosacchariden mittels Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie. Zur Identifikation von unbekannten Strukturen werden die Molekülmassen (A) und Collision Cross Sections (B) der intakten Oligosaccharide und ihrer Fragmente mit Referenzdaten aus der Datenbank glycomob.org (C) verglichen.
Komplexe Oligosaccharide - oft auch Glycane genannt - sind Biomakromoleküle die eine essentielle Rolle bei der Proteinfaltung, der Zellerkennung, und dem Informationstransfer in lebenden Organismen spielen. Im Gegensatz zu linear verknüpften Biopolymeren wie DNA und Proteinen sind Glycane verzweigt und stereochemisch komplex, was eine enorme Herausforderung für ihre Charakterisierung darstellt.
 
Die Struktur von Glycanen wird durch drei Parameter bestimmt: Komposition, Konnektivität und Konfiguration (Abb. 1). Die Komposition entspricht der Art der vorhandenen Monosaccharid-Bausteine. Diese Bausteine sind oft Isomere, besitzen also die gleiche Summenformel jedoch eine unterschiedliche Anordnung der Atome. Im Falle von Glucose (Glc) und Galactose (Gal) liegt der Unterschied zum Beispiel nur in der Stereochemie einer Hydroxylgruppe an einem bestimmten Kohlenstoffatom. Jedes Monosaccharid enthält wiederum mehrere Hydroxylgruppen die jeweils glycosidische Bindungen zum nächsten Baustein ausbilden können. Deshalb sind Glycane oft verzweigte Strukturen mit komplexer Regiochemie. Darüber hinaus können bei der Bildung einer glycosidische Bindung jeweils zwei Konfiguration entstehen, die sogenannte α- oder β-Konfiguration. Bereits zwei Bausteine können so in einer Vielzahl von Möglichkeiten miteinander verbunden werden und jedes Molekül besitzt dabei unterschiedliche chemische und physikalische Eigenschaften.
 
Kombination von Ionenmobilitätsspek-trometrie und Massenspektrometrie
Die derzeit wichtigste Methode zur Untersuchung von Glycanen ist die Massenspektrometrie (MS). Mit dieser Technik lassen sich auch für kleineste Probenmengen verlässliche Informationen über die Zusammensetzung eines Moleküls erlangen. Für die Untersuchung von Isomeren liefert die Bestimmung der Masse jedoch meist nur unzureichende Informationen, da sowohl die intakten Moleküle als auch ihre Fragmente häufig eine identische atomare Zusammensetzung aufweisen. Schon einfache Konnektivitäts- und Konfigurationsisomere lassen sich deshalb oft nur schwer voneinander unterscheiden. Ein vielversprechender Ansatz zur Lösung dieses inhärenten Problems ist die Kombination von Ionenmobilitätsspektrometrie und Massenspektrometrie.

Mit dieser Technik werden Analytionen nicht nur nach ihrer Masse und Ladung, sondern zusätzlich auch hinsichtlich ihrer Größe und Form getrennt. In der Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS) misst man die Zeit, die Ionen benötigen, um unter dem Einfluss eines schwachen elektrischen Felds durch eine mit Helium oder Stickstoff gefüllte Driftzelle zu wandern (Abb. 2). Kompakte Ionen erfahren dabei weniger Kollisionen mit dem Driftgas als gestreckte Ionen und erreichen deshalb deutlich schneller das Ende der Zelle. Dieses Prinzip ermöglicht die Trennung von Spezies mit gleicher Masse, aber unterschiedlicher Struktur. Darüber hinaus kann die gemessene Driftzeit in einen rotationsgemittelten Kollisionsquerschnitt (collision cross section, CCS) umgerechnet werden, der nicht instrumentenabhängig und deshalb universell vergleichbar und datenbankenfähig ist. Der besondere Vorteil der Methode ist, dass die CCS als zusätzliche Information gewonnen wird, der Proben- und Zeitbedarf mit dem der konventionellen Massenspektrometrie jedoch vergleichbar ist.

 
IM-MS Geräte sind seit einigen Jahren kommerziell erhältlich und die Technik wird bereits in größerem Maßstab zur Charakterisierung von kleinen Molekülen, Peptiden, Proteinen und Clustern genutzt [1]. Erste Versuche an isomeren Glycanen zeigten vielversprechende Ergebnisse, eine breite Anwendung der IM-MS im Bereich der Glycoanalytik blieb bisher jedoch aus. Um das tatsächliche Potential dieser Methode für die Analyse von Oligosacchariden zu bestimmen, haben wir isomere Modellsubstanzen die sich in jeweils nur einem Strukturmerkmal unterscheiden systematisch untersucht [2]. Auf diese Weise wurde es erstmals möglich, den Einfluss von kleinen Strukturunterschieden sowie der Ionenpolarität und Adduktbildung auf die IM-MS Trennung systematisch zu evaluieren.
 
IM-MS als Methode zur Trennung von Glycan-Isomeren
Unsere Ergebnisse zeigen, dass IM-MS eine äußerst leistungsfähige Methode zur Trennung von Glycan-Isomeren ist [2]. Voraussetzung hierfür ist jedoch, das nicht wie bisher üblich positiv geladene Na+-Addukte, sondern negativ geladene, deprotonierte Ionen analysiert werden. In diesem Fall ist es möglich Konnektivitäts- und Konfigurationsisomere zweifelsfrei anhand ihrer CCS zu identifizieren (Abb. 3A und B). Noch beeindruckender ist die Fähigkeit zur Analyse von Mischungen. Gemische aus Regio- und Stereoisomeren können basislinienrein voneinander getrennt werden, was eine relative Quantifizierung möglich macht. Größere Glycane sind als intakte Ionen anhand ihrer CCS häufig nicht zweifelsfrei unterscheidbar. Unsere Experimente zeigen jedoch, dass die CCSs von Glycan-Fragmenten oft ebenfalls sehr diagnostisch sind (Abb. 3B), was eine strukturelle Zuordnung auch dann möglich macht wenn die intakten Moleküle selbst nicht trennbar sind. 
 
Ein essentieller Bestandteil für den von uns verfolgten Ansatz zur Sequenzierung von Glycanen ist eine leistungsfähige Datenbank. Dort können kombinierte m/z- und CCS-Daten für bekannte und bisher zweifelsfrei charakterisierte Strukturen hinterlegt und anschließend als Referenz zur Analyse von unbekannten Molekülen genutzt werden (Abb. 3C). Um einen langfristigen Erfolg dieser Datenbank zu erreichen wurde sie so konzipiert, dass sie frei zugänglich, einfach zu nutzen, nachhaltig und von vielen unterschiedlichen Arbeitsgruppen bestückbar ist. Die neue Datenbank glycomob.org [3] wurde deshalb im Rahmen einer größeren, internationalen Kooperation entwickelt und in das Datenbank-Netzwerk UniCarbKB [4] eingebettet, in dem Oligosaccharid-Informationen aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Methoden vereint sind. Das langfristige Ziel ist dabei nicht nur IM-MS Daten in glycomob.org zu hinterlegen, sondern diese auch mit den bereits in UniCarbKB existierenden chromatographischen und massenspektrometrischen Informationen zu verknüpfen.
 
Anwendungsbeispiele
Zukünftig ist die Charakterisierung von komplexen Oligosacchariden mittels IM-MS besonders für zwei Anwendungsbereiche interessant: I) Synthesekontrolle und II) Sequenzierung von Glycanen und Glycoconjugaten aus biologischen Quellen. Die Synthese von Oligosacchariden mit Festphasentechniken hat in den letzten Jahren enorme Fortschritte gemacht [5]. Die Charakterisierung der hergestellten Produkte stellt jedoch nach wie vor eine enorme Herausforderung dar. Ein dabei besonders häufig auftretendes Problem ist die Bildung von Produktgemischen beim Knüpfen von glycosidischen Bindungen. Die entstehenden Konfigurationsisomere können in der Regel nur mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) charakterisiert werden, wozu große Probenmengen, viel Zeit und eine aufwändige Auswerteprozedur nötig ist. Für geringe Verunreinigungen unter 5% ist eine Detektion und Analyse auch mittels NMR in der Regel nicht möglich. Mit der von uns erarbeiteten Methode können Konnektivitäts- und Kontigurationsisomere basislinienrein getrennt werden. Auf diese Weise ist es möglich auch für kleinste Probenmengen den Gehalt von Verunreinigungen semiquantitativ abzuschätzen. Da der Probenbedarf in der IM-MS vergleichsweise gering ist, wäre auch eine Kontrolle von einzelnen Kupplungsschritten denkbar. 
 
Das zweite wesentliche Anwendungsgebiet ist ohne Frage die Analyse und Sequenzierung von biologisch relevanten Oligosacchariden. Besonders die Zuordnung unbekannter Strukturen anhand von kombinierten m/z und CCS-Fingerprints (Abb. 3) ist äußerst vielversprechend und hat großes Potential die Glycomik entscheidend voran zu bringen. Unsere Arbeiten zeigen außerdem, dass die Methode nicht notwendigerweise auf isolierte Glycane beschränkt ist. Erste Anwendungen in der Glycoproteomik sind bereits in Arbeit und auch eine Nutzung der Technik zur Analyse von anderen Glycoconjugaten, wie zum Beispiel Glycolipiden, ist vorstellbar. Einer Automatisierung der Analyse für Hochdurchsatz-Anwendungen steht ebenfalls nichts im Wege; die benötigten Technologien werden routinemäßig in der Proteomik genutzt und eine geeignete Datenbank ist bereits entwickelt. Kurzum: die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie hat das Potential, die Analytik von Glycanen und Glycoproteinen zu revolutionieren.
 

Referenzen:
[1] a) B. C. Bohrer, S. I. Merenbloom, S. L. Koeniger, A. E. Hilderbrand, D. E. Clemmer, Annual Review of Analytical Chemistry 2008, 1, 293-327; b) C. Uetrecht, R. J. Rose, E. van Duijn, K. Lorenzen, A. J. R. Heck, Chemical Society Reviews 2010, 39, 1633-1655; c) F. Lanucara, S. W. Holman, C. J. Gray, C. E. Eyers, Nature Chemistry 2014, 6, 281-294.
[2] J. Hofmann, H. S. Hahm, P. H. Seeberger, K. Pagel, Nature 2015, 526, 241-244, DOI: 10.1038/nature15388.
[3] W. B. Struwe, K. Pagel, J. L. P. Benesch, D. J. Harvey, M. P. Campbell, Glycoconjugate Journal 2015, DOI: 10.1007/s10719-10015-19613-10717.
[4] M. P. Campbell, R. Peterson, J. Mariethoz, E. Gasteiger, Y. Akune, K. F. Aoki-Kinoshita, F. Lisacek, N. H. Packer, Nucleic Acids Research 2014, 42, D215-D221.
[5] a) O. Calin, S. Eller, P. H. Seeberger, Angewandte Chemie International Edition 2013, 52, 5862-5865; b) P. H. Seeberger, Accounts of Chemical Research 2015, 48, 1450-1463, DOI: 10.1021/ar5004362.

Autoren
Kevin Pagel
(corresponding author)
Freie Universität Berlin
Institut für Chemie und Biochemie
Berlin
www.bcp.fu-berlin.de/chemie/pagel

Johanna Hofmann
Fritz-Haber-Institut der Max-Planck-Gesellschaft
Berlin

 
Mehr informationen zu Kopplungstechnik: http://www.git-labor.de/search/gitsearch/Kopplungstechnik
Einführung in die Ionenmobilitätsspektrometrie: https://duepublico.uni-duisburg-essen.de/

 

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