Meilensteine der Lichtmikroskopie

Jubiläumsbeitrag 2016

  • Abb.1: Mikroskop von Robert Hooke.Abb.1: Mikroskop von Robert Hooke.
  • Abb.1: Mikroskop von Robert Hooke.
  • Abb.2: Zeiss Mikroskop ca 1901. © Bryn Mawr College Special Collections
  • Abb.3: Patentschrift des Konfokalmikroskops von Marvin Minsky.
  • Abb.4: Bild aus der Patentschrift für das Tandem-Scanning-Mikroskop Jubiläumsbeitrag GIT
  • Abb.5: 4Pi Aufnahme © Andy Nestl
  • Abb.6: Prototyp des Zeiss LSM © ZEISS Microscopy
  • Abb.7: Phalloidin markierte Actin Filamente als Vergleich zwischen STED und kofokaler Mikroskopie © Howard Vindin

1950: Wer hat‘s erfunden?
Die Historiker streiten bis heute um die Namen derer, die das erste optische Mikroskop mit zusammengesetzten Linsen gebaut haben sollen. Es wird u.a. berichtet, dass Zacharias Janssen, ein Brillenmacher aus Middelburg, Ende des 16. Jahrhunderts der erste Erfinder gewesen sein soll. 1609 entwickelte der italienische Astronom Galileo Galilei ein aus einer konvexen und einer konkaven Linse zusammengesetztes Mikroskop. 1625 wurde der Begriff Mikroskop (aus dem Griechischen, Vorsilbe „mikros“ steht für klein und „skopein“ für Sehen) von dem deutschen Arzt und Botaniker Johannes Faber von Bamberg eingeführt.
In seinem Werk „Micrographia“, veröffentlichte Robert Hooke 1665 zahlreiche mikroskopische Abbildungen (Abb.1). 1676 beschrieb der niederländische Naturforscher Antonie van Leeuwenhoek erstmals lebende Einzeller und Bakterien (Bazillen, Kokken und Spirillen). Er entwarf auch eine neue Methode zur Herstellung von Linsen, die eine 270-fache Vergrößerung erlaubten. Jedoch nahm er seine Kunst des Linsenherstellens mit ins Grab, so dass es nach seinem Tod fast 250 Jahre dauerte, bis es wieder gelang, Mikroskope mit vergleichbar hoher Auflösung zu konstruieren. 1830 beschrieb der Physiker Joseph Jackson Lister einen Weg, die sphärische Abberation durch die Kombination zweier achromatischer Kittglieder zu beheben. Ernst Abbe begründete dann 1871-73 das heute noch gültige Theorem für die Auflösungsbegrenzung in der Mikroskopie. Der Weggefährte von Carl Zeiss und Miteigentümer der gleichnamigen Optik-Firma in Jena entwickelte die Theorie zur Bildentstehung im Mikroskop und stellte damit den Mikroskopbau auf eine wissenschaftliche Grundlage. Einer der wesentlichen Verdienste des deutschen Physikers war das damals bei vielen Herstellern übliche und aufwendige Probierverfahren bei der Zusammensetzung der optischen Systeme, das sogenannte „Pröbeln“, durch eine berechnete Optik zu ersetzen.

1930-32 entwickelte der niederländische Chemiker und Physiker Frits Zernike das erste Phasenkontrastmikroskop, welches das Beobachten von transparenten Proben wie z.B. Zellen ohne entsprechendes Anfärben ermöglicht.

Die Bedeutung dieser Entwicklung wurde zunächst unterschätzt und so erfuhr das Phasenkontrastmikroskop erst ab 1941 seinen industriellen Durchbruch. Zernike bekam für seine Leistung 1953 den Nobelpreis für Physik verliehen. Bereits 1946 beschrieb der deutsche Physikochemiker Theodor Förster den Förster-/Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET), bei dem die Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffes (Donor) strahlungsfrei auf den unmittelbar benachbarten Fluoreszenzfarbstoff (Akzeptor) übertragen wird, der daraufhin fluoresziert. Mit dieser Methode lassen sich u.a. Protein-Protein-Interaktionen in Echtzeit mit einer zeitlichen Auflösung im Millisekundenbereich beobachten.

50er: Konfokal
In dieses Jahrzehnt fällt die Geburtsstunde des „konfokalen Prinzips“. Marvin Minsky baute das erste punktrasternde Konfokalmikroskop (Abb.3). Seiner Überlegung zugrunde lag die Vermeidung des störenden Streulichtes, das bei der Beobachtung der Gewebestrukturen von Gehirnschnitten sehr hinderlich ist.
Nicht so bekannt sind die Konzepte für konfokale Rastermikroskope von Klaus Weber. Für das Rastern sah der Mitarbeiter der Ernst Leitz in Wetzlar drei Möglichkeiten: erstens, synchron laufende Nipkow-Scheiben: eine in der Ebene der Leuchtfeldblende und eine in der Zwischenbildebene; zweitens, synchron bewegliche Lochfeldblenden in der Leuchtfeld- und in der Zwischenbildebene und drittens, die Verschiebung des Strahlengangs mittels Kippspiegel.
Da es zu dieser Zeit noch keine geeigneten digitalen oder fotografischen Dokumentationsmöglichkeiten gab, dauerte es noch weitere 30 Jahre, bis sich das Konzept der konfokalen Mikroskopie endgültig durchsetzte.

Die 50er Jahre waren geprägt durch die Mikrophotographie. Der Einbau bzw. die Adaptierung von Kleinbild- bzw. Schmalfilmkameras in bzw. an das Mikroskop erschloss die Dokumentation für Weitfeldabbildungen und fortan konnten die Beobachtungen auf Kleinbild- und Schmalfilm aufgenommen werden.

60er: Fluoreszenz
Stewart J. Strickler und Robert A. Berg ebneten mit dem von ihnen beschriebenen Zusammenhang zwischen der Absorptionsintensität und der Fluoreszenzlebensdauerrate von Molekülen die Entwicklung der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM).
Die beiden Mediziner Mojmír Petrá und Maurice David Egger publizierten wissenschaftliche Daten, die mit Hilfe des ersten bildgebenden, konfokalen Mikroskops mit Nipkow-Scheibe (Tandem-Raster/Scanning-Mikroskop, TSM) beobachtet wurden (Abb.4). Ende der 60er Jahre datiert die Geburtsstunde des ersten konfokalen Laser-Raster/Scanning-Mikroskops. Maurice Egger und Paul Davidovits veröffentlichten eine Arbeit zum ersten konfokalen Mikroskop mit Laserlicht als Punktscanner. Die Autoren spekulierten bereits über einen Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen für in vivo-Beobachtungen.

70er: Eine andere Welt
Die technische Entwicklung der Lichtmikroskopie führte auch in den 70er Jahren zu einer Ausweitung der Anzahl visualisierbarer Mikrostrukturen. Insbesondere in der Zellphysiologie wurden erhebliche Fortschritte erreicht. Zum Beispiel lieferten Dieter Weiß und weitere Mitarbeiter eine detaillierte Beschreibung von Mikrotubuli und den mit ihnen assoziierten Systemen. Diese wichtigen Schritte bei der Aufklärung der Tubulinstruktur lösten weitere wissenschaftliche Durchbrüche in der Medizin, unter anderem in der Krebsforschung, aus.

Auf der Basis des Konfokalmikroskopes entwickelten Douglas Magde und andere Wissenschaftler die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (fluorescence correlation spectroscopy, FCS). Diese Technik spielt zum Beispiel in der molekularen Biophysik bei der Bestimmung der Größe und des Faltungszustandes von Proteinen eine wichtige Rolle. Auch die pharmazeutische Forschung profitierte von neuen Methoden in der Fluoreszenzmikroskopie. Zu erwähnen ist hier insbesondere FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching). Werden Fluoreszenzmarker in einer Probe durch einen Laserpuls lokal deaktiviert (man spricht bei diesem Vorgang von Photobleaching), so diffundieren fluoreszierende Moleküle aus der Umgebung wieder in den deaktivierten Bereich und mit Hilfe einer Intensitätsmessung der Fluoreszenz kann die Diffusionsgeschwindigkeit bestimmt werden. Diese Methode eröffnete die Möglichkeit zur Untersuchung der mikroskopischen Mobilität und Interaktion von Molekülen mit einer bis dahin noch nicht erreichten Genauigkeit.

Einen wesentlichen Innovationsschub erhielt die Lichtmikroskopie schon in den 70er Jahren durch die Arbeiten von Christoph Cremer und Thomas Cremer. Die Wissenschaftler schlugen vor, Laserlicht von allen Seiten (Raumwinkel 4Pi) auf einen Punkt mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm zu fokussieren und die Probe dann Punkt für Punkt zu rastern (Abb.5). Erkenntnisse aus dieser 4Pi-Mikroskopie flossen auch in das Konzept der Konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie für Fluoreszenz (confocal laser scanning microscopy, CSLM) ein. Auch hier wird eine Probe von einem fokussierenden Laserstrahl punktweise gerastert, wobei spezifisch markierte Bereiche zur Fluoreszenz angeregt werden. Das Bild wird dann wie bei der Rasterelektronenmikroskopie auf elektronischem Weg punktweise zusammengesetzt.

Mit einem Auflicht-Konfokal-Mikroskop zeigten Colin Sheppard und Tony Wilson eine wertvolle Weiterentwicklung, in der die Probe nicht nur in der Fokusebene, sondern auch entlang der optischen Achse bewegt werden konnte. So erhielten sie optische Serienschnitte von zum Beispiel integrierten optischen Schaltkreisen.
Analoge Videokameras ermöglichten die Aufzeichnung von Bildsequenzen. Diese Ergänzung des Instrumentariums zeigte seine Stärke insbesondere bei der Sichtbarmachung der Veränderungen von Zellbestandteilen in Lage und Form sowie bei der Darstellung von Konzentrationen verschiedener Substanzen in lebenden Zellen.

80er: Revolutionen
Anfang der 80er Jahre hielt die Elektronik zunehmend Einzug in die Lichtmikroskopie. Mit den Fortschritten in der Informationstechnologie entstanden zudem Möglichkeiten, die klassischen Methoden der Lichtmikroskopie mit digitalen bildgebenden und bildverarbeitenden Verfahren zu kombinieren. Die Leistungsfähigkeit der Lichtmikroskopie war nun nicht mehr an die Eigenschaften des menschlichen Auges gebunden. Vorgänge, die sich bisher nur mit dem Elektronenmikroskop visualisieren ließen, konnten jetzt zeitaufgelöst in vivo dargestellt werden. Neben Videokameras wurden auch besonders lichtempfindliche charge-coupled-device-(CCD)-Kameras für die Bildaufzeichnung eingesetzt. Direkt nach der Aufzeichnung konnten digitale Bilddaten in einem schnellen Prozessor zur Kontrastverstärkung, Hintergrundsubtraktion und Filterung, verarbeitet und schließlich als Grundlage für eingehende Analysen herangezogen werden.

Auch technische Verbesserungen bestehender Konzepte lieferten einen Beitrag zur Überwindung der bisherigen Limitierungen hinsichtlich der Geschwindigkeit der Bildrate und der Steuerelemente, der Probenbelastung, der lateralen und axialen Auflösung: Bei der konfokalen Laser-Scanning–Mikroskopie nach dem Punktscanner-Prinzip, wurde beim Rastern bisher das Präparat bewegt, der Beleuchtungspunkt blieb starr. Diese Instrumente waren oftmals empfindlich gegenüber Erschütterungen und zudem auch langsam. W. Amos und J. White entwickelten Mitte der 80er Jahre das erste konfokale Beam-Scanning-Mikroskop, bei dem die Probe fest war und der Beleuchtungspunkt bewegt wurde. Eine geeignete Software ermöglichte die präzise Steuerung der Scanmotoren für die Spiegel. Mit ihrem Aufbau konnten bereits vier Bilder pro Sekunde mit jeweils 512 Zeilen aufgenommen werden.

Die technischen Neuerungen fanden schon sehr schnell Eingang in den kommerziellen Bereich. Die ersten Laser-Scanning-Mikroskope wurden 1982 von Oxford Optoelectronics (SOM-25) und Carl Zeiss (LSM) angeboten. Der LSM-Prototyp kann heute im Deutschen Museum, München, besichtigt werden.

Treibende Faktoren bei der instrumentellen und methodischen Entwicklung der Lichtmikroskopie waren insbesondere die steigende Rechenleistung von Computer und Grafikkarten, zunehmender Speicherplatz, leichtere Bedienung, weitere Motorisierung und Automation. Auch die Nutzung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) beeinflusste die Entwicklung der Lichtmikroskopie, insbesondere die Techniken FLIM, FRAP, FRET, nachhaltig. Die Bereitstellung verschiedener Varianten des GFP ist vielleicht der bekannteste Beitrag von Roger Tsien, der 2008 den Nobelpreis für Chemie erhielt.

Sowohl die Digitalisierung der Lichtmikroskopie als auch die instrumentelle Weiterentwicklung führten zu einem Überschreiten der Grenzen des „Mikroskopierens mit dem Auge“. Dieter Weiss spricht von einer Renaissance der Lichtmikroskopie und einem Paradigmenwechsel in der Zellbiologie: „Durch sie wurde das seit den 50er Jahren durch die Elektronenmikroskopie dominierte statische Bild der Zelle durch eine völlig neue Sicht der hochgeordneten intrazellulären Bewegungen abgelöst.“ Die Dynamik von Zellstrukturen konnten detaillierter erforscht werden, einzelne Proteinmoleküle konnten in der lebenden Zelle quantitativ dargestellt und verfolgt werden, zelluläre Prozesse konnten mit hoher Präzision zeitlich aufgelöst werden, chemisch-physikalische Eigenschaften konnten visualisiert werden.

90er: Schärfer als das Licht erlaubt
Die bahnbrechenden methodischen Innovationen der vergangenen Jahre kamen zur Marktreife. Namhafte Hersteller wie Leica, Olympus, Carl Zeiss und Nikon stellten neue Konfokale Mikroskopsysteme und anwendungsspezifische Objektive vor. Insbesondere in der Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie wurden weitere Fortschritte erzielt. Neben vielen interessanten Neuerungen stellten insbesondere die Erfindung der Lichtscheibenmikroskopie (lightsheet fluorescence microscopy, LSFM, oder single plane illumination microscopy, SPIM), die 4Pi-konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Double-confocal scanning microscopy) sowie die Fluoreszenzlöschung durch stimulierte Emission (stimulated emission depletion, STED) wichtige Meilensteine dar.

Der Jenaer Physiker Ernst Abbe erkannte bereits 1873 das zentrale Problem der Lichtmikroskopie: nämlich, dass die Auflösung nie über die halbe „Wellenlänge des blauen Lichts um ein Nennenswertes hinausgehen wird“. Verantwortlich ist die Wellennatur des Lichtes. Auch die neuen Verfahren der Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie konnten die beugungslimitierte Auflösungsgrenze nicht überwinden. Kein Wunder, dass sich Naturwissenschaftler in den vergangenen Jahrzehnten andere Mikroskopiearten, wie zum Beispiel die Elektronen-, Rastertunnel-, oder Nahfeldmikroskopie, einfallen ließen. Die nichtinvasive Abbildung des Inneren von Zellen war mit diesen hochauflösenden Verfahren jedoch schwer zu realisieren.

Stefan Hell und Thomas Klar gelang es mit Hilfe des Konzeptes der Fluoreszenzlöschung durch stimulierte Emission (stimulated emission depletion, STED) die Beugungsgrenze in der Fluoreszenzmikroskopie zu durchbrechen. Bei diesem fundamentalen Ansatz wurde ein nahezu kugelförmiger fokaler Spot erzeugt, dessen resultierendes Volumen mit 670 Zeptolitern etwa 18mal kleiner ist als beim konfokalen Mikroskop. Die eigentliche bahnbrechende Idee war die Löschung der Fluoreszenz der Farbstoffmoleküle am Rande des ursprünglich angeregten Bereiches. Die Forscher arbeiteten dazu mit zwei Abfolgen ultrakurzer Laserpulse. Dabei war die Intensitätsverteilung des STED-Strahles ringförmig um den Anregungsspot geformt. So konnte die Fluoreszenz im Randbereich des Fokus unterdrückt und die Fluoreszenz in der Mitte des Spots verschont werden. Eine erste Anwendung dieses Verfahrens auf E. coli-Bakterien zeigte eine Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze und Details in den Abbildungen, die bisher mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie verborgen geblieben sind. Insbesondere die Neurowissenschaften profitierten von der Turbomikroskopie. Synapsen liegen genau an der Auflösungsgrenze der bisherigen Lichtmikroskopie. Die Wandlungsfähigkeit der Synapsen beeinflusst neurologische Prozesse wie das Lernen. Mit Hilfe von STED konnten bereits Details im Aufbau und die zeitliche Veränderung der winzigen Objekte sichtbar gemacht werden.

2000er: Super-resolution Microscopy
Das Durchbrechen einer lange anerkannten Grenze der Physik hatte sich schnell herumgesprochen. Auch andere Forscherteams versuchten Methoden der Lichtmikroskopie zu entwickeln, um den Nanometerbereich aufzulösen. Die Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (photoactivated localization microscopy, PALM) wurde von Eric Betzig und Kollegen entwickelt. Sie konnten hierbei die Fluoreszenz einzelner Moleküle lichtgesteuert ein- und ausschalten. Der Schaltvorgang erfolgte über einen gewissen Zeitraum, so dass einige Bilder aufgenommen werden konnten. Mit Hilfe des Computers ließ sich die Position einzelner Moleküle jenseits der Abbe’schen Auflösungsgrenze bestimmen. Die Technik wurde parallel auch von anderen Gruppen entwickelt, so dass in der Fachliteratur andere Bezeichnungen auftauchen (S.T. Hess, FPALM, X. Zhuang, STORM).

STED und PALM erschienen als wichtige Vertreter einer neuen Klasse hochauflösender Techniken der Lichtmikroskopie, die man allgemein mit „Super-resolution microscopy“ bezeichnet.

2014 erhielten Eric Betzig, Stefan Hell und William Moerner für die Entwicklung superauflösender Fluoreszenzmikroskopie den Nobelpreis für Chemie.
Anfang des 21. Jahrhunderts gab es auch im kommerziellen Bereich eine außerordentliche Dynamik. Die ersten in Serie produzierten STED-Mikroskope wurden von Leica Microsystems auf den Markt gebracht. Mit der Entwicklung der hochauflösenden Lichtmikroskopie entstand auch ein Bedarf an komplementärer Labortechnik, zum Beispiel Brutschränke für Live Cell Imaging und Produkte für die Automatisierung. Der Innovationsschub bei den Methoden führte auch zu einer signifikanten Weiterentwicklung der Komponenten wie Kameras, Objektive mit hoher numerischer Apertur, Objektive mit adaptiver Optik, apochromatisch korrigierter Objektive, usw.

Wie Ernst Abbe bereits 1873 geschrieben hat, ist die von ihm formulierte Auflösungsgrenze bei der halben Wellenlänge nur gültig, „so lange nicht Momente geltend gemacht werden, die ganz außerhalb der Tragweite der aufgestellten Theorie liegen“. Offensichtlich ist es so gekommen.

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