Miniaturisierung in der Chromatographie

Die Injektion, das unbekannte und komplexe Wesen

  • Tab. 1: Vergleich der relativen Standardabweichung (RSD) zwischen der Full-Loop- und Metered-Injektion mittels Mikro-LC-MS/MS für drei Zytostatika bei einer Konzentration von 10 ng mL-1.Tab. 1: Vergleich der relativen Standardabweichung (RSD) zwischen der Full-Loop- und Metered-Injektion mittels Mikro-LC-MS/MS für drei Zytostatika bei einer Konzentration von 10 ng mL-1.
  • Tab. 1: Vergleich der relativen Standardabweichung (RSD) zwischen der Full-Loop- und Metered-Injektion mittels Mikro-LC-MS/MS für drei Zytostatika bei einer Konzentration von 10 ng mL-1.
  • Abb. 1: Darstellung des maximalen Injektionsvolumens (bezogen auf 10% Vcol,eff) in Abhängigkeit des Innendurchmessers der Trennsäule.
  • Abb. 2: Vergleich eines a) Fixed-Loop und b) eines Flow-Through Autosamplers.
  • Abb. 3: Veranschaulichung der „Full-Loop“-Injektion eines Fixed-Loop Autosamplers. a) Befüllen der Probenschleife, b) Schalten des Ventils in den Flussweg zur Analyse, c) Rausschalten der Probenschleife aus dem Flussweg.
  • Abb. 4: Veranschaulichung der zeitgesteuerten Injektion (metered-injection) eines Fixed-Loop Autosamplers. a) Befüllen der Probenschleife, b) zeitabhängige Schaltung des Ventils in den Flussweg, c) Rausschalten der Probenschleife inklusive Start des Gradienten.

Die Miniaturisierung in der Chromatographie bedingt, dass auch das Injektionsvolumen entsprechend angepasst werden muss. Während bei Verwendung analytischer Säulen mit einem Innendurchmesser (ID) zwischen 2,1 mm und 4,6 mm mehrere Mikroliter injiziert werden, kann dies bei Mikro- oder Nano-LC-Säulen dramatische Auswirkungen auf die Trenneffizienz haben. Der folgende Beitrag will deshalb aufzeigen, welche technischen Konzepte für miniaturisierte HPLC-Systeme existieren, das Injektionsvolumen gering zu halten.

Abhängigkeit des Injektionsvolumens vom Säulenvolumen

Je kleiner die Säule, desto kleiner sollte auch das Injektionsvolumen sein, um die durch den Injektionspfropfen verursachte Bandenverbreiterung zu minimieren. Nach einer „Faustregel“ beträgt das maximale Injektionsvolumen 10% des effektiven Säulenvolumens, das anhand der folgenden Gleichung berechnet werden kann:

Das effektive Säulenvolumen beschreibt den Volumenanteil in der Säule, der tatsächlich durch die mobile Phase eingenommen wird. Neben dem Durchmesser (dc) und der Länge (L) der Trennsäule hängt dieses Volumen von der Porosität (ε) der Packung ab. Bei vollporösen Partikeln ergibt sich somit ein größeres effektives Säulenvolumen als bei teilporösen Partikeln mit identischem Durchmesser, wodurch eine höhere Beladbarkeit der Phase resultiert. Die Auftragung in Abbildung 1 zeigt den Verlauf des „maximalen“ Injektionsvolumens in Abhängigkeit des Säuleninnendurchmessers. Hierbei wurde eine Säulenlänge von 5 cm bei einer Porosität von 70% angenommen.

Das maximale Injektionsvolumen verringert sich somit von 58 µL, wenn eine 4,6 mm ID Säule verwendet wird, auf 12 µL bei Nutzung einer 2,1 mm ID Säule. Beträgt der Innendurchmesser nur noch 300 µm, wie bei der Mikro-LC, so sollten lediglich 250 Nanoliter injiziert werden. Es stellt sich nun die Frage, welche technischen Konzepte existieren, solche geringen Volumina reproduzierbar auf die Säule zu überführen.

Autosamplertypen und Injektionsmodi

Generell wird zwischen zwei Autosamplertypen, die jeweils verschiedene Injektionsmodi ermöglichen, unterschieden.

Dabei wird zwischen dem sogenannten Fixed-Loop und Flow-Through Autosampler differenziert. Beide Varianten sind in Abbildung 2 dargestellt.

Beide Autosampler ermöglichen entweder die sogenannte Partial-Loop oder die Full-Loop-Injektion. Während bei der Partial-Loop-Injektion nur ein Teil der Probenschleife befüllt wird, wird die Schlaufe bei der Full-Loop-Injektion vollständig mit der Probenlösung gefüllt und das gesamte Probenvolumen der Injektionsschlaufe auf die Säule transferiert. Dies kann anhand der Bildabfolge in Abbildung 3 am Beispiel eines Fixed-Loop Autosamplers nachvollzogen werden. Unabhängig vom Autosamplertyp und Injektionsmodus ist die Probenschleife während der kompletten Analyse sowohl beim Fixed-Loop als auch beim Flow-Through Autosampler üblicherweise in den Flussweg geschaltet und trägt somit zum Gradientenverweilvolumen bei.

In Bezug auf den Flow-Through Autosampler werden bei analytischen HPLC-Systemen i. d. R. Injektionsschlaufen mit einem Volumen zwischen 20 µL oder 100 µL verwendet, die bei Nutzung eines Mikro-LC-Systems aufgrund des hohen Volumens ungeeignet sind. Würde also eine Injektionsschlaufe mit einem Volumen von 100 µL bei einer Flussrate von 20 µL min-1 verwendet werden, ergäbe dies eine Verweilzeit von fünf Minuten, bis der Gradient vollständig durch die Injektionsschlaufe gelaufen ist. Um die Verweilzeit für den Flow-Through Sampler dennoch zu minimieren, kann natürlich das Ventil (nach der Injektion) aus dem Flussweg geschaltet werden. Ein entscheidender Vorteil des Fixed-Loop Autosamplers gegenüber dem Flow-Through Autosampler bleibt jedoch bestehen; dieser liegt in dem geringeren Beitrag zur Bandenverbreiterung, da wie in Abbildung 3 dargestellt ist, kein Needle-Seat bzw. keine Needle-Seat Kapillare benötigt und somit von der Probenbande durchflossen wird. Daher empfiehlt es sich für die Mikro-LC einen Fixed-Loop Autosampler einzusetzen, da hier eine höhere Flexibilität in Bezug auf das Probenschleifenvolumen (≤ 10 µL) gegeben ist. Dadurch kann der oben angesprochene Beitrag zum Gradientenverweilvolumen deutlich minimiert und gleichzeitig eine geringere Bandenverbreiterung erreicht werden. Soll an dieser Stelle eine Full-Loop-Injektion durchgeführt werden, müsste z. B. für ein Volumen von 250 nL eine Schlaufe von 12,7 cm Länge bei einem Durchmesser von 50 µm verwendet werden. Dies ist technisch möglich, allerdings ist dann keine Flexibilität bezüglich höherer Injektionsvolumina gegeben.

Zeitgesteuerte Injektion

Die Faustregel für das „maximale“ Injektionsvolumen leitet sich aus der Tatsache ab, dass polare Verbindungen auf einer Umkehrphase wenig oder keine Retention erfahren und somit mit dem Injektionspfropfen durch die Säule transportiert werden. Unpolare Verbindungen lassen sich jedoch sehr gut auf einer Umkehrphase anreichern bzw. fokussieren, wenn das Injektionslösungsmittel nur einen geringen oder gar keinen Anteil eines organischen Lösungsmittels enthält. Vor diesem Hintergrund ist es also sinnvoll, das Schlaufenvolumen auch bei Mikro-LC-Systemen auf 5 µL oder sogar 10 µL zu erhöhen, um in Bezug auf eine großvolumige Direktinjektion (LVI - large volume injection) größere Flexibilität zu haben und einen ständigen Umbau der Injektionsschlaufe zu vermeiden. Je größer das absolute Schlaufenvolumen bei einer Full-Loop-Injektion ist, desto größer ist auch, wie bereits mehrfach dargelegt, der Beitrag zum Gradientenverveilvolumen. Um trotzdem ein geringes Probenvolumen auf die Säule zu überführen und das Gradientenverweilvolumen gleichzeitig gering zu halten, ermöglichen dedizierte Mikro-LC Systeme die sog. zeitgesteuerte Injektion (Metered-Injection) (siehe Bildabfolge in Abb. 4).

Die Schlaufe ist in diesem Fall wie bei der Full-Loop-Injektion vollständig gefüllt, es wird aber nur ein Teil der Probe aus der Schlaufe auf die Säule überführt. Hierzu wird die Schlaufe nur während einer definierten Zeit, z. B. eine Sekunde, in den Fluss geschaltet. Nach Ablauf der Überführungszeit wird die Schlaufe aus dem Fluss genommen. Mit Hilfe dieser Technik können sogar sehr kleine Volumina injiziert werden. Bei dem von uns verwendeten Mikro-LC-System (Eksigent Express-LC ultra) beträgt die minimale Transferzeit 150 ms. Bei einer Flussrate von z. B. 25 µL min-1 ergibt sich ein minimales Injektionsvolumen von 62,5 nL. Dieses ist also deutlich unter den für eine Mikro-LC-Säule mit einem ID von 300 µm empfohlenen Injektionsvolumen. Wird die Flussrate auf 50 µL min-1 erhöht, so verdoppelt sich auch das Injektionsvolumen auf 125 nL, wenn die Transferzeit konstant gehalten wird. Durch das Prinzip der zeitgesteuerten Injektion ist somit ein äußerst flexibler Aufbau gegeben. Das Injektionsvolumen kann auf diese Weise immer an die Bedingungen der analytischen Methode angepasst werden, ohne die Injektionsschlaufe zu wechseln. Sollen beispielsweise unpolare Verbindungen, die nur in geringer Konzentration in der Probe enthalten sind, analysiert werden, kann eine großvolumige Direktinjektion von mehreren Mikrolitern mittels einer Full-Loop-Injektion auf eine Mikro-LC-Säule durchgeführt werden, wenn die Zusammensetzung des Injektionslösungsmittels eine Fokussierung am Säulenkopf erlaubt. Auf der anderen Seite kann das Injektionsvolumen durch eine zeitgesteuerte Injektion bis auf wenige Nanoliter reduziert werden, wenn die zu quantifizierende Verbindung in hoher Konzentration mit einem sensitiven Detektor, wie z. B. einem Massenspektrometer, erfasst werden soll. Eine Verdünnung der Probe vor der Analyse ist auf diese Weise nicht notwendig, da die Signalintensität über die Anpassung des Injektionsvolumens gesteuert werden kann.

Robust und reproduzierbar

Natürlich stellt sich sofort die Frage, ob die Technik robust ist und reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden. Dass dies so ist, möchten wir anhand der folgenden Daten belegen. In Tabelle 1 sind vergleichend die Standardabweichungen einer 10-fach Injektion von drei Zytostatika mittels Mikro-LC-MS/MS für die Injektionstechniken Full-Loop (Vinj = 8 µL) und Metered (Vinj = 4 µL) dargestellt. Anhand der vorliegenden Daten ist ersichtlich, dass die relative Standardabweichung unabhängig von der angewandten Technik anzusehen ist. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass es sich um ungeglättete massenspektrometrische Daten im unteren Konzentrationsbereich handelt und die Abweichungen daher nicht mit der UV Detektion verglichen werden können.

Fazit

Aus theoretischer Perspektive wird bei der Miniaturisierung immer auch die Reduzierung des Injektionsvolumens angestrebt. Dass dies heutzutage mit den kommerziell verfügbaren Systemen technisch möglich ist, haben wir demonstriert. Aus praktischer Sicht ist es aber in vielen Fällen notwendig, das Injektionsvolumen deutlich größer zu wählen, als dies durch die zu Beginn definierte Faustregel (VInj,max entspricht 10% Vcol,eff) vorgegeben wird. Der Grund ist in der Art der Detektion und den erforderlichen Nachweisgrenzen zu suchen. Je geringer das Volumen bzw. die Stoffmenge an Analyt ist, die in das System eingespeist wird, desto sensitiver muss das Detektionsverfahren sein. Im Bereich der Bioanalytik ist das Probenvolumen häufig limitiert. Eine Säule mit einem kleineren ID erzeugt dann bei gegebenem konstanten Injektionsvolumen immer ein höheres Signal als eine Säule mit einem größeren ID. Im Bereich der Umweltanalytik ist das verfügbare Probenvolumen i. d. R. nicht limitiert und die Nachweisgrenzen sind häufig sehr klein (1 ng L-1 oder sogar geringer). In diesem Fall muss auch bei sehr sensitiven Detektoren eine großvolumige Direktinjektion durchgeführt werden.

Autoren
T. Teutenberg1, T. Hetzel1, J. Leonhardt1

Zugehörigkeiten
1Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA), Duisburg, Deutschland

Kontakt
Dr. Thorsten Teutenberg

Bereichsleiter Forschungsanalytik
Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Duisburg, Deutschland
teutenberg@iuta.de

Projekt Fortschrittliche Chromatographie
Chemgapedia Lerneinheit(en) zur Micro-LC

Haben Sie Fragen zur Anwendung und Technik im Bereich Mikro-LC und 2D-LC? Fragen Sie die Experten vom IUTA: adlichrom@iuta.de

 

 

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