Moderne Raman-Spektroskopie Aus Sicht der Forschung und Entwicklung

Janus-Artikel: Die „moderne" Raman Spektroskopie: Aus Sicht der Forschung und Entwicklung, sowie der Industrie. In diesem Artikel lesen Sie die Raman-Spektroskopie aus der Sicht der Forschung Entwicklung. Die Sicht der Industrie von Harald Fischer und Dr. Olaf Hollrichter, Witec Ulm, lesen Sie hier. Eine allgemeine Einleitung zum Thema finden Sie hier: http://www.git-labor.de/

Raman-Spektroskopie, insbesondere Raman-Mikroskope sind für die Forschung flexibel und vielseitig einsetzbar. Raman-Spektren lassen sich für beinahe jede Anregungswellenlänge vom ultravioletten über den sichtbaren Spektralbereich bis ins nahe Infrarot aufnehmen.

Dabei gilt es zu beachten, dass die Raman-Intensität indirekt proportional zur vierten Potenz der Anregungswellenlänge ist. Somit ergibt eine Raman-Anregungswellenlänge von 244 nm ein ca. 350 x stärkeres Raman-Signal als eine Anregungswellenlänge von 1064 nm. Jedoch kann eine Anregungswellenlänge von 244 nm zu einer Zerstörung empfindlicher Proben führen. Bei der Wahl der Anregungswellenlänge gilt es zu beachten, dass evtl. auftretende Fluoreszenz das schwache Raman-Signal nicht überlagert.

Wellenlängen

Die Auswahl einer geeigneten Wellenlänge ist auch dahingehend entscheidend, als dass die Raman-Signale bestimmter Moleküle durch Anregung in eine elektronische Absorption resonant verstärkt werden können. Diese Resonanz-Bedingung führt zu einer enormen Verstärkung einiger Schwingungsmoden im Vergleich zum Raman-Spektrum aufgenommen unter nicht-resonanten Bedingungen. Resonanz-Raman-Spektren sind im Vergleich zu nicht-resonanten Raman-Spektren einfacher zur intepretieren, da viel weniger Schwingungen im Spektrum auftreten. Es werden nur die Schwingungen beobachtet, die resonant an den elektronischen Übergang gekoppelt sind, mit dem der Anregungslaser resonant ist.

Dies ist bei großen Moleküle besonders interessant, da man durch geeignete Wahl des Anregungslaser nur einen relativ kleinen Bereich des Moleküls, der dem resonanten Bereich des Moleküls, der dem resonanten Chromophor zugeordnert werden kann, anregt. Resonanz-Raman-Spektren lassen sich jedoch nur beobachten, falls die Resonanz-Raman-Spektren nicht durch die gleichzeitige Anregung von Fluoreszenz überlagert werden. Bei der Verwendung von Anregungswellenlängen im tiefen UV Bereich (z. B. 244 nm) kommt neben der 1/λ4 Verstärkung noch meistens der Resonanz-Raman-Effekt zum Tragen. Da die meisten Moleküle jedoch oberhalb von 250 nm keine Fluoreszenz mehr zeigen, sind Raman-Spektren aufgenommen im tiefen UV meist fluoreszenzfrei und zeigen ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis. 244 nm Anregung eignet sich z. B. zur UNtersuchung von Mineralien wie z. B. Meteoriten. Jedoch ist die Erzeugung von 244 nm Dauerstrichlaserlicht (intra cavity Frequenzverdopplung von 488 nm Argonionenlaserlicht) zum einen sehr komplex und bedarf speziell geschulten Personals, zum anderen aber vor allem sehr kostspielig. Eine perfekte Raman-Anregungswellenlänge gibt es nicht. Die Auswahl der Wellenlänge hängt dabei von der Problemstellung, d. h. von der zu untersuchenden Probe und natürlich von der Verfügbarkeit für die Raman-Spektroskopie geeigneter Laser (idealerweise leistungsstarker monochromatischer Dauerstrichlaser) ab. Im Falle biologischer Proben haben sich Laserwellenlängen von 532 nm bis zu 1064 nm als vorteilhaft erwiesen, da in diesem Bereich ein günstiges Verhältnis von Signalstärke und niedriger Zerstörraten sowie der Vermeidung von störender Autofluoreszenz von biologischem Gewebe liegt. So hat sich die Verwendung von 785 nm als vorteilhaft zur molekular-pathologischen Charakterisierung von Gewebe sowie zur Klassifizierung/Identifizierung verschiedene Tumor- und Körperzellen erwiesen. Mit 532-nm-Anregung hingegen lassen sich pathogene Mikroorganismen sehr gut detektieren und identifizieren - eine Gewebecharakterisierung ist mit dieser Wellenlänge aufgrund starker Autofluoreszenz kaum möglich.

Detektion

Die Empfindlichkeit eines Raman-Systems wird druch gute Sammeleigenschaften für das Raman-Streulicht, hohen Lichtdurchsatz der Optik und einen für den Spektralbereich des inelastisch gestreuten Raman-Lichtes passenden Detektor ermöglicht. Dazu kommen für den sichtbaren Spektralbereich siliziumbasierte CCD-Detekroen zum Einsatz. Für Anregung im nahen Infrarot, d. h. von Wellenlängen größer als 1 µm zeigen CCD-Detektoren eine deutlich geringere Dynamik und Quanteneffizienz, weswegen in diesem Spektralbereich oft auf Indium-Gallium-Arsenid-Detektoren zurückgegriffen wird. Entsprechend vielgestaltig ist auch das Design kommerzielle erhältlicher Raman-Geräteplattformen, die den Forschungsmarkt adressieren.

Anwendungen

Mittels dieser kommerziellen Forschungsgeräte konnte in den letzten Jahren gezeigt werden, dass Raman-Methoden ideale Werkzeuge für die Medizin und Lebenswissenschaften darstellen, da sie kontaktfrei messen und Informationen über molekulare Prozesse in Zellen liefern, ohne dass die Proben zuvor aufwändig präpariert oder nach der Messung zerstört sind. Außerdem sind biologische Proben unterschiedlicher Größen analysierbar, von ganzen Organen über Gewebeschnitte, Zellen, Viren bis hin zur DNA/RNA. Eine Vielzahl an Studien zur Anwendung der Raman-Spektroskopie in der medizinischen Diagnostik wurde in der letzten Dekade veröffentlicht. Neue Konzepte für eine Krebsfrühdiagnostik bis hin zur schnellen Erkennung von Infektionserregern (Bakterien, Viren) (siehe http://bit.ly/Virus-Raman) gehörten dabei zu den brennenden Fragen, die mittels innovativer Raman-basierter Ansätze erfolgreich adressiert wurden. Obwohl die Raman-Spektroskopie ihre Leistungsfähigkeit zur medizinischen Diagnostik bereits vielfach unter Beweis gestellt hat, gibt es bisher keine nennenswerten Aktivitäten in Richtung eines Routineeinsatzes der Raman-(Mikro)spektroskopie z. B. für den direkten Einsatz vor Ort (Point-of-Care-Einsatz (POC)) zur schnellen Identifizierung von Krankheitserregern. Ein POC-Ansatz erlaubt die Möglichkeit einer patientennahen Sofortdiagnostik. Dies geht einher mit einem geringen Bedarf an Probenmaterial, dem Wegfall von Probentransport und vor allem die rasche Verfügbarkeit von Analyseresultaten zur zeitnahen Diagnose, Verlaufsbeurteilung und Therapiekontrolle. Neben den o. g. kostenintensiven und leistungsstarken für den Forschungsmarkt konzipierten Raman-Geräte existieren zwar portable Raman-Spektrometer, die für den Vor-Ort-Einsatz konzipiert sind, jedoch noch immer viel zu teuer sind und technologisch nicht den Anforderungen genügen um in POC-Ansätzen Anwendungen zu finden. Der Großteil der kommerziell erhältlichen portablen oder mobilen Raman-Systeme sind dafür ausgelegt, unbekannte Pulver- und Flüssigproben aus Explosivstoffen, Industriechemikalien oder Medikamenten zu identifizieren oder kommen in der Archäometrie zum Einsatz. Biologische Proben liefern jedoch weitaus schwächere und vor allem komplexere Raman-Signaturen als derartige Proben und sind zudem einander meist sehr ähnlich, sodass diese tragbaren Geräte mangels Sensitivität und Spezifität nicht für den Einsatz als POC-Sensoren im klinischen Umfeld geeignet sind. Zudem ist es für einen POC-Einsatz notwendig, dass der Betrieb ohne spezielle technische Fachkenntnisse erfolgt und die Qualität der Ergebnisse der der konventionellen Forschungs-Raman-Geräte entspricht. Daneben hängt die Verbrietung von POC-Ansätzen maßgeblich, neben technologischen Fortschritten, von der Kosten- und Vergütungssituation ab. Deshalb ist bei der Entwicklung eines entsprechenden POC-Raman-Ansatzes die Wirtschaftlichkeit des Gesamtverfahrens sicherzustellen, was ein möglichst preiswertes Messinstrument einschließt.

Ausblick

Generell erfordert die Übertragung vieler Fragestellungen, die mittels Raman-Spektroskopie erfolgreich im Labor adressiert werden konnten, in die reale Welt, kleine kompakte und auch preiswerte Raman-Geräte für den Vor-Ort-Einsatz. Beispiele hierfür sind Vor-Ort-Wasseruntersuchungen, eine Vor-Ort-Raman-Gasanalytik (speziell von N2 und O2) z. B. in Bohrlöchern, Vor-Ort-Lebensmittelanalytik z. B. zum Nachweis von pathogenen Erregern in Fleisch, zur industriellen Prozessanalytik bzw. Prozessüberwachung etc. Dabei besteht die Herausforderung die Raman-Geräte hinsichtlich Anregungswellenlänge, spektrale Auflösung, Sensitivität etc. auf die zu adressierende Fragestellung abzustimmen. Der Bedarf an großen flexiblen Labor-Raman-Geräten bleibt natürlich weiter bestehen, um die Machbarkeit und die notwendigen Parameter zur Beantwortung der o. g. verschiedenen Fragestellungen zu evaluieren.

Autoren
Michael Schmitt
, Friedrich-Schiller-Universität Jena
Prof. Dr. Jürgen Popp, Friedrich-Schiller-Universität Jena, IPHT Jena

 

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