Nanoskopie in HD-Qualität

Super-aufgelöste Mikroskopie mit konventionellen Mikroskopen

  • Abb. 1: Ein Laser wird von links in den Wellenleiter-Chip eingekoppelt. Das evaneszente Feld des Lichts, welches sich im planaren Wellenleiter ausbreitet, kann Fluoreszenz entlang seiner gesamten Ausdehnung anregen. Da das Signal von einem konventionellen aufrechten Mikroskop detektiert wird, lassen sich bestehende Instrumente einfach mit dieser Technik nachrüsten.
  • Abb. 2: Wellenleiter lassen sich mit fast unbeschränkter Größe auf Chips produzieren. Durch die Nutzung eines 0,5 mm breiten Wellenleiters kann das Aktin-Netzwerk von mehr als 50 Krebszellen gleichzeitig in Super-Auflösung aufgenommen werden.
Hier wird ein Wellenleiter-Chip vorgestellt, der super-auflösende Fluoreszenzmikrosopie („Nanoskopie“) mit einer Auflösung von mehr als 50 nm auf konventionellen Mikroskopen ermöglicht [1]. Die neue Technik zeichnet sich durch einfache Handhabung aus und benötigt keine komplexen oder kostspieligen Mikroskop-Aufbauten.
 
Zusätzlich bietet der massenproduzierbare Wellenleiter-Chip, verglichen mit anderen Verfahren, ein deutlich größeres Gesichtsfeld. Diese Entwicklung hat daher das Potenzial, die super-auflösende Mikroskopie für viele neue Nutzer zugänglich zu machen und neue Anwendungen zu erschließen.
 
Einleitung
 
Nach der Entwicklung des Mikroskops durch Galilei, haben sich diese über Jahrhunderte als eines der wesentlichen wissenschaftlichen Werkzeuge etabliert. Zunächst wurde angenommen, dass die höchstmögliche Auflösung lediglich durch die Fertigkeiten der Linsenschleifer begrenzt war. Der deutsche Physiker Ernst K. Abbe konnte jedoch 1873 zeigen, dass die erreichbare optische Auflösung grundsätzlich durch die Welleneigenschaften des Lichts auf ca. 200 nm beschränkt ist. Über hundert Jahre später wurden schließlich verschiedene Verfahren entwickelt, wie diese fundamentale Begrenzung dennoch umgangen und eine höhere, sprich „Superauflösung“, erreicht werden kann [2]. Zu diesen zählen Techniken der strukturierten Beleuchtung („Structured Illumination Microscopy“, SIM [3]), stimulierten Emission („STimulated Emission Depletion“, STED [4], sowie fluktuationsbasierte Methoden (“Super-resolution Optical Fluctuation Imaging”, SOFI [5], und „Entropy-based Super-resolution Imaging“, ESI [6]). Zu den am weitesten verbreiteten Techniken gehören jedoch Methoden, die auf der hochpräzisen Lokalisation einzelner Moleküle basieren [7].
 
Lokalisationsanalyse
 
Im Jahr 2006 wurden von drei Arbeitsgruppen nahezu gleichzeitig und unabhängig voneinander solche super-auflösenden Methoden entwickelt [8-10]. Bereits 2014 wurde der Nobelpreis in Chemie für die Entwicklung der super-auflösenden Mikroskopie verliehen; unter anderem an Eric Betzig, der schon 1995 das zugrundeliegende Prinzip der Isolation und Lokalisation einzelner Moleküle vorgeschlagen hatte [1].

Andere lokalisationsbasierte Verfahren werden daher als Abwandlungen dieser Technik gesehen. Hierbei kommen photoaktivierbare oder -schaltbare fluoreszente Proteine oder andere, beispielsweise organische, Fluorophore zum Einsatz. Diese können optisch zwischen einem hellen, fluoreszierenden („an“-) Zustand und einem dunklen, nicht fluoreszierenden („aus“-) Zustand reversibel geschaltet werden. directSTORM (dSTORM) nutzt das Photoschaltverhalten vieler organischer Farbstoffe aus [7, 12, 13], mit denen sich beispielsweise Strukturen in Zellen gezielt anfärben lassen. Wird zu jedem Zeitpunkt lediglich ein sehr kleiner Anteil der Fluorophore stochastisch aktiviert, so ist die Fluoreszenzemission örtlich und zeitlich separiert. In einer Sequenz von mehreren hundert bis tausend Einzelbildern werden die Positionen der einzelnen Fluoreszenzemissionen mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern bestimmt. Alle gefundenen Lokalisationen werden schließlich zu einem super-aufgelösten Bild zusammengesetzt, wodurch sich Strukturen bis zu 20 nm auflösen lassen.

 
Fluktuationsanalyse
 
Andere Verfahren der super-auflösenden Mikroskopie basieren ebenfalls auf der Analyse der Dynamik in der Fluoreszenzemission. Im Gegensatz zu den lokalisationsbasierten Ansätzen sind bei den Techniken, die sich eine Fluktuationsanalyse zu Nutze machen, keine örtlich separierten Emitter erforderlich. Vielmehr werden die zeitlichen Fluktuationen der Fluoreszenzemission in mehreren hundert Einzelbildern analysiert. Es erfolgt dabei eine zeitabhängige statistische Betrachtung auf der Ebene einzelner Pixel, wobei beispielsweise Kumulanten (SOFI)  [5] oder Entropien (ESI) [6] berechnet werden. Im Allgemeinen erzielen diese Verfahren, verglichen mit lokalisationsbasierten, eine schlechtere örtliche Auflösung. Da sie aber deutlich weniger Einzelbilder zur Rekonstruktion eines super-aufgelösten Bildes benötigen, sind sie in Bezug auf die zeitliche Auflösung dem anderen Verfahren überlegen.
 
Auf den Kopf gestellt
 
Im Gegensatz zur hohen Komplexität des Mikroskops zur Datenaufnahme verwenden die derzeit etablierten Methoden der Nanoskopie jedoch nur einen recht einfachen Objektträger, auf dem sich lediglich die zu untersuchende Probe befindet. Nun wurde das Verhältnis umgedreht. Es wurde ein komplexer optischer Chip für die Strahlführung und Probenhalterung verwendet, aber ein einfaches und kostengünstiges Mikroskop für die Datenaufnahme. Optische Wellenleiter führen, aufgrund des Prinzips der Totalreflektion, Licht durch einen Kern, der aus einem höheren Brechungsindex als das umgebende Mantelmaterial besteht. Trotzdem entsteht aus Stetigkeitsgründen ein sog. evaneszentes Feld außerhalb des Wellenleiters, das in einem Bereich von wenigen hundert Nanometern an der Oberfläche des Chips exponentiell abfällt. Dieses Feld ist dennoch stark genug, um Fluoreszenz in Proben anzuregen, die sich direkt an der Oberfläche des Chips befinden.
 
Chips
 
Mittels dieser Chips können nun Bildausschnitte von bis zu 0.5 mm × 0.5 mm gleichzeitig aufgenommen werden. Dieses wird ermöglicht, da das evaneszente Feld auf dem Wellenleiter-Chip generiert wird und somit von der Detektionsoptik des Mikroskops unabhängig ist. Dementsprechend sind die Strahlengänge zur Beleuchtung und Detektion komplett entkoppelt und anstelle spezieller Objektive können nahezu beliebige eingesetzt werden. Das starke evaneszente Feld, das vom Wellenleiter ausgeht, kann sowohl zum Photoschalten der Moleküle sowie zur Fluoreszenzanregung genutzt werden, was die zuvor beschriebene einzelmolekülbasierte Lokalisationsmikroskopie ermöglicht. Aber zusätzlich lässt sich ein weiterer Effekt nutzen. Die Interferenzmuster zahlreicher Moden bewirken örtliche Fluktuationen in der Fluoreszenzanregung und ermöglichen eine Auflösungserhöhung anhand einer Fluktuationsanalyse durch Anwendung des ESI-Verfahrens. Unsere Aufnahmen des Tubulin-Zellskeletts einer Leberzelle sollen die Vorteile der einzelnen Techniken verdeutlichen: Während für ein beugungsbegrenztes Bild keine besondere algorithmische Verarbeitung notwendig ist (Aufmacherbild, links), zeigt die ESI-Rekonstruktion aus lediglich 200 Einzelbildern bereits eine erhöhte Auflösung (Aufmacherbild, Mitte). Die höchste Auflösung wird schließlich mit der dSTORM-Rekonstruktion aus 40.000 Einzelbildern erreicht (Aufmacherbild, rechts). Diese Ergebnisse verdeutlichen die Leistungsfähigkeit der unterschiedlichen Verfahren und ihre Grenzen in Bezug auf die zeitliche und örtliche Auflösung. Verwendet man hingegen ein Objektiv mit einer deutlich niedrigeren Vergrößerung, so lassen sich mehr mit der Chip-basierten Nanoskopie sogar mehr als 50 Zellen zeitgleich darstellen (Abb. 2).
 
Einfacher kann besser sein
 
Wellenleiter-Chips sorgen für eine erhebliche Verringerung der Komplexität eines Mikroskopaufbaus und haben das Potenzial, neue Anwendungsbereiche zu erschließen und zugleich die Kosten deutlich zu senken. Sie bieten daher die Chance, den Bereich der Nanoskopie für eine Vielzahl neuer Anwender zugänglich zu machen. Wird das Anregungslicht durch optische Fasern zum Wellenleiter-Chip geführt, können sogar etliche Standardmikroskope auf Nanoskope aufgerüstet werden. Zukünftige Entwicklungen, wie beispielweise Chip-integrierte Laser oder hochintegrierte Strahlführungen, werden die Möglichkeiten vermutlich weiter vergrößern. Durch die integrierte Plattform ist es außerdem einfach, Nanoskopie mit anderen Lab-on-a-Chip-Methoden, wie Mikrofluidik oder optischen Fallen, zu kombinieren.
 
Danksagung
 
Wir danken unseren Kooperationspartnern Øystein I. Helle, Cristina I. Øie, Peter McCourt, Thomas R. Huser und Balpreet S. Ahluwalia. Weiterer Dank an Matthias Simonis für das Foto in Abbildung 1 und Rajwinder Singh und Deanna L. Wolfson für die Präparation der in Abbildung 2 gezeigten Zellen. Diese Arbeit wurde vom Deutschen Akademischen Austauschdienst gefördert.
 
Autoren
Robin Diekmann1, Mark Schüttpelz1
 
Zugehörigkeiten
1Universität Bielefeld, Fakultät für Physik, Bielefeld
 
Kontakt   
Mark Schüttpelz
Universität Bielefeld
Fakultät für Physik
Bielefeld
schuettp@physik.uni-bielefeld.de
 
 

Referenzen:

[1] Diekmann, R. et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics 11, 322-328, doi:10.1038/Nphoton.2017.55 (2017).

[2] Schermelleh, L., Heintzmann, R. & Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology 190, 165-175, doi:10.1083/jcb.201002018 (2010).

[3]. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc 198, 82-87 (2000). DOI:10.1046/j.1365-2818.2000.00710.x

[4] Hell, S. W. & Wichmann, J. Breaking the Diffraction Resolution Limit by Stimulated-Emission - Stimulated-Emission-Depletion Fluorescence Microscopy. Optics Letters 19, 780-782, Doi:10.1364/Ol.19.000780 (1994).

[5] Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S. & Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). P Natl Acad Sci USA 106, 22287-22292, doi:10.1073/pnas.0907866106 (2009).

[6] Yahiatene, I., Hennig, S., Muller, M. & Huser, T. Entropy-Based Super-Resolution Imaging (ESI): From Disorder to Fine Detail. Acs Photonics 2, 1049-1056, doi:10.1021/acsphotonics.5b00307 (2015).

[7] Heilemann, M. et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl 47, 6172-6176, doi:10.1002/anie.200802376 (2008).

[8] Betzig, E. et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 313, 1642-1645, doi:10.1126/science.1127344 (2006).

[9] Hess, S. T., Girirajan, T. P. & Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J 91, 4258-4272, doi:10.1529/biophysj.106.091116 (2006).

[10] Rust, M. J., Bates, M. & Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods 3, 793-795, doi:10.1038/nmeth929 (2006).

[11] Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Opt Lett 20, 237-239 (1995).

[12] Heilemann, M., van de Linde, S., Mukherjee, A. & Sauer, M. Super-resolution imaging with small organic fluorophores. Angew Chem Int Ed Engl 48, 6903-6908, doi:10.1002/anie.200902073 (2009).

[13] van de Linde, S. et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc 6, 991-1009, doi:10.1038/nprot.2011.336 (2011).

 

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