Arrays aus Glas mit zehntausenden mikroskopisch kleiner Kammern eignen sich ideal zum Einschließen einer großen Anzahl einzelner Enzymmoleküle, deren individueller Substratumsatz gleichzeitig mittels Fluoreszenzmikro­skopie beobachtet werden kann. Im Vergleich zu anderen Einzelmolekül-Techniken erübrigt das Einschließen jede Art von Oberflächenanheftung und der hohe Grad der Parallelisierung macht es möglich, eine statistisch repräsentative Enzym-Population zu analysieren.

Methoden zur Einzelmolekül-Analyse eröffnen neue Horizonte

Die Entwicklung neuer Technologien zur Einzelmolekül-Analyse hat unseren Erkenntnishorizont, wie wir über biochemische Reaktionen denken, wesentlich erweitert. So werden kinetische Details und Subpopulationen von Enzymmolekülen sichtbar, die zuvor mit Ensemble- bzw. Masse-Experimenten nicht zugänglich waren. Einzelne Enzymmoleküle zeigen einerseits Substratumsatzschwankungen in aufeinander folgenden katalytischen Zyklen, die als dynamische Heterogenität bezeichnet werden. Andererseits wurden große Unterschiede im Substratumsatz zwischen einzelnen Enzymmolekülen beschrieben, die als statische Heterogenität bezeichnet werden. Statische und dynamische Heterogenität werden auf unter­schiedliche Konformationen zurückgeführt [1]. Zur Analyse der statischen Heterogenität benötigt man eine große Anzahl individueller Enzymmoleküle. Die meisten Einzel-Molekül-Techniken erlauben es jedoch nur ein einzelnes oder wenige Moleküle gleichzeitig zu untersuchen. Zudem ist es häufig erforderlich, die Enzymmoleküle an einer Oberfläche zu immobilisieren, was einen Einfluss auf die Aktivität und die Substratzugänglichkeit des Enzyms haben kann.

Femtoliter-Arrays zur Isolierung individueller Enzymmoleküle

Ein ganz anderer Ansatz beruht dagegen auf der Isolierung individueller Enzymmoleküle in mikroskopisch kleinen Kammern mit einem Volumen von 50 µm³ (bzw. Femtolitern), was in etwa der Größe einer Hefezelle entspricht. Sogenannte Femtoliter-Arrays bestehen aus einer homogenen Anordnung aus Tausenden solcher Kammern, die beispielsweise in PDMS geformt oder in die Oberfläche von Glas geätzt werden können [2].

In diese Femtoliter-Arrays kann eine stark verdünnte Enzymlösung eingeschlossen werden, so dass sich separate Reaktionsgefäße bilden. Bei Unterschreitung einer bestimmten Konzentration im pikomolaren Bereich ist nicht mehr genügend Enzym vorhanden, um jede Kammer zu füllen. Daher ist der Substratumsatz auf einzelne Kammern beschränkt, und die Belegung der Kammern weist eine Poisson-Verteilung auf [3].

Bei einem Verhältnis von einem Enzymmolekül pro Kammer bedeutet dies, dass es nicht nur Kammern gibt, die mit einem Enzymmolekül belegt sind, sondern auch solche, die kein Molekül oder aber zwei oder mehr enthalten. Wenn die Konzentration jedoch so gewählt wird, dass nur in jeder 20. Kammer ein Enzymmolekül vorliegt, dann bleibt zwar der Großteil der Kammern leer, aber die restlichen 5 % der Kammern enthalten mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit nur ein einziges Enzymmolekül. Bei einem Femtoliter-Array aus 50.000 Kammern können in diesem Fall immer noch 2.500 Enzymmoleküle beobachtet werden. Zur Aktivitätsbestimmung individueller Enzymmoleküle wird gleichzeitig ein fluorogenes Substrat mit einer - im Vergleich zum Enzym - hohen Konzentration in den Kammern eingeschlossen. In denjenigen Kammern, die ein Enzymmolekül enthalten, wird das Substrat in ein fluoreszierendes Produkt überführt und der Signalanstieg kann unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer sensitiven Kamera aufgezeichnet werden.

Neue Erkenntnisse über Einzelmolekülmechanismen

Eine Möglichkeit zur Herstellung von Femtoliter-Arrays bieten spezielle optische Glasfaserbündel [4] aus 50.000 einzelnen Glasfaserkernen (weiß), die in einer Matrix (grau) aus einer anderen Elementarzusammensetzung eingebettet sind (Abb. 1). Wegen der unterschiedlichen Dotierung lässt sich das Kernmaterial spezifisch ätzen, so dass ein homogener Array aus 50.000 Kammern entsteht. Das Anregungs- und Emissionslicht wird durch Totale Interne Reflektion in den einzelnen Glasfasern zwischen proximalem und distalem Ende des Glasfaserbündels geleitet, wobei jede Kammer mit jeweils einer Glasfaser verbunden ist. In den Arrays wurden die Modellenzyme β-Galactosidase [5] und Meerettichperoxidase [6] eingeschlossen und analysiert. Die hohe Anzahl der parallelen Messungen erlaubte es, eine statistisch repräsentative Population individueller Enzymmoleküle unter identischen Bedingungen zu analysieren.

Individuelle Moleküle der β-Galactosidase zeigten konstante aber deutlich voneinander unterschiedliche Substratumsatzraten. Die Ursache dieser stati­schen Heterogenität konnte auf den katalytischen Schritt zurückgeführt werden, nicht aber auf die Substratbindung an das Enzym. Durch den Zusatz eines kompetitiven Inhibitors für β-Galactosidase wurde erstmals experimentell gezeigt, dass kompe­titive Enzyminhibition auf der Einzelmolekül-Ebene ein stochastischer Prozess ist [7]. Die Assoziation und Dissoziation des Inhibitors wird durch wiederholte Sub­stratumsatzschwankungen einzelner Enzymmoleküle sichtbar. Die Inhibitionskonstante Ki ist in Ensemble-Messungen defi­niert als Inhibitorkonzen­tration, bei der die Hälfte der Enzyme inhibiert ist. Die Einzelmolekül-Analyse erfor­dert jedoch eine stochastische Sichtwese der Enzymkinetik. Das bedeutet, dass ein einzelnes Enzymmolekül bei einer Inhibitorkonzentration von [I] = Ki an jedem beliebigen Zeitpunkt mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % inhibiert ist. Die In­hi­bitionskonstanten können aus der Autokorrelationsanalyse der Zeitverläufe be­rechnet werden und stimmen mit Literaturangaben von Ensemble-Experimenten überein.