Perspektivenwechsel in der bildgebenden Massenspektrometrie

Identifizierung von Stoffwechselprodukten auf Blattoberflächen

  • Abb. 1: Die molekulare Diversität eines Probenvolumens, wie zum Beispiel eines Tumors, lässt sich mit Hilfe  bildgebender Massenspektrometrie (MSI) in ihrer Gesamtheit erfassen, indem das Volumen in Schichten abgetragen und analysiert wird. Je dünner die Schichtdicke gewählt wird, desto kleiner sind die Unterschiede in der Probenzusammensetzung zwischen den einzelnen Gewebepräparaten. So können die Daten von komplementären Methoden oft direkt korreliert und ausgewertet werden. Das Anfertigen von Gewebepräparaten ist ein wichtiger Bestandteil der Probenvorbereitung in der medizinischen Forschung und Diagnostik, was die Integration von MSI-Methoden in den bestehenden Arbeitsablauf erleichtert.Abb. 1: Die molekulare Diversität eines Probenvolumens, wie zum Beispiel eines Tumors, lässt sich mit Hilfe bildgebender Massenspektrometrie (MSI) in ihrer Gesamtheit erfassen, indem das Volumen in Schichten abgetragen und analysiert wird. Je dünner die Schichtdicke gewählt wird, desto kleiner sind die Unterschiede in der Probenzusammensetzung zwischen den einzelnen Gewebepräparaten. So können die Daten von komplementären Methoden oft direkt korreliert und ausgewertet werden. Das Anfertigen von Gewebepräparaten ist ein wichtiger Bestandteil der Probenvorbereitung in der medizinischen Forschung und Diagnostik, was die Integration von MSI-Methoden in den bestehenden Arbeitsablauf erleichtert.
  • Abb. 1: Die molekulare Diversität eines Probenvolumens, wie zum Beispiel eines Tumors, lässt sich mit Hilfe  bildgebender Massenspektrometrie (MSI) in ihrer Gesamtheit erfassen, indem das Volumen in Schichten abgetragen und analysiert wird. Je dünner die Schichtdicke gewählt wird, desto kleiner sind die Unterschiede in der Probenzusammensetzung zwischen den einzelnen Gewebepräparaten. So können die Daten von komplementären Methoden oft direkt korreliert und ausgewertet werden. Das Anfertigen von Gewebepräparaten ist ein wichtiger Bestandteil der Probenvorbereitung in der medizinischen Forschung und Diagnostik, was die Integration von MSI-Methoden in den bestehenden Arbeitsablauf erleichtert.
  • Abb. 2: A) Viele biologisch interessante Oberflächen haben eine charakteristische Topografie, welche sich in etablierten MSI-Methoden als hinderlich erweist. B) Der klassische Ansatz der flachen Präparate ist eine Möglichkeit eine sonst nicht analysierbare Probe zugänglich zu machen und ist üblicherweise mit extensiver Probenvorbereitung verbunden. C) Eine profilometrische Vermessung der Probenoberfläche erlaubt eine Anpassung der Probenposition entlang der Höhenachse Z in Abhängigkeit zur Oberflächentopografie. Auf diese Art und Weise kann eine komplexe und /oder bewegte Oberfläche direkt analysiert werden.
  • Aleš Svatoš
  • Benjamin Bartels

Die massenspektrometrische Analyse von räumlichen Verteilungen bekannter und unbekannter Verbindungen ist ein rasant wachsendes Forschungsfeld. Trotz 20 Jahre intensiver Forschung stellen unebene Oberflächen biologischer Proben weiterhin eine große Herausforderung dar und limitieren die routinierte Anwendung in Bereichen abseits der humanmedizinischen Forschung und Diagnostik. Eine Kombination aus Profilometrie und räumlich hochauflösenden Ionisierungstechniken verspricht auch diese Proben einer Analyse zugänglich zu machen.

Bildgebende Massenspektrometrie

Massenspektrometrie ist ein beliebtes analytisches Werkzeug, das Anwendung in zahlreichen wissenschaftlichen Bereichen findet.  Von der Identifizierung einzelner Bestandteile eines komplizierten Stoffgemisches bis zur atomaren Zusammensetzung einer Probe – je nach angewandter Methodik lässt sich eine Vielzahl an chemischen Informationen gewinnen.  Mit der Einführung des Elek-trosprays 1989 als Ionisierungsmethode für große Biomoleküle [1], spätestens jedoch seit der Entwicklung von Matrix-assistierter Laser-Desorption/Ionisierung (MALDI) [2] und der darauffolgenden Anwendung als bildgebendes Verfahren [3, 4] ist Massenspektrometrie auch aus der Bioanalytik nicht mehr wegzudenken. Vorteilhaft gegenüber anderen Methoden ist bei der Massenspektrometrie das breite Spektrum an Informationen, das sich in Sekundenschnelle gewinnen lässt. Während die Fluoreszenzmikroskopie im Hinblick auf räumliche Auflösung und Spezifizität noch immer überlegen ist, erlaubt die Massenspektroskopie die parallele Beobachtung von Hunderten molekularen Signalen gleichzeitig, ohne dass vorher spezifische Marker in die Probe eingebracht werden müssen. Heute, 20 Jahre nach der Einführung von MALDI, ist die bildgebende Massenspektrometrie biologischer Proben ein rasant wachsendes Forschungsfeld [5].

Hierbei fokussiert sich ein Großteil der Aktivität auf die medizinische Forschung und Diagnostik. Die Anwendungsmöglichkeiten in der Krebsforschung und pharmazeutischen Entwicklung haben zu einer schnellen Akzeptanz nicht nur im akademischen Labor, sondern auch in den Entwicklungsabteilungen themenverwandter Konzerne geführt.

Das gesteigerte Interesse der Industrie und Wirtschaft ist neben der akademischen Forschung ein treibender Faktor für die zunehmende Kommerzialisierung der Methode und Geräteentwicklung seitens der Hersteller von Massenspektrometern weltweit. Eine Ursache für die vergleichsweise schnelle Akzeptanz ist die Probenvorbereitung, wie das Anfertigen von Gewebeschnitten für die Mikroskopie, welche sich gut mit den etablierten Methoden der bildgebenden Massenspektrometrie verbinden lässt. Ausschlaggebendes Kriterium ist dabei die Topografie der Probenoberfläche. Ein Gewebeschnitt ist per Definition flach, denn die Probe soll möglichst an jeder Stelle die gleiche Dicke haben, entweder, um bei Anfärbung in der Mikroskopie eine vergleichbare Farbintensität vorzuweisen, oder –  im Falle der bildgebenden Massenspektrometrie – um das gleiche Volumen an extrahierbarem Material für die Ionisierung bereitzustellen. Bei einem MALDI-Experiment bedeutet dies beispielsweise, dass der Durchmesser des Laserspots auf der Probe konstant gehalten werden muss, um die Resultate zweier Bildpunkte vergleichbar zu machen. Ist die Topografie der untersuchten Fläche nicht flach, ändert sich der Abstand zwischen Proben-oberfläche und Fokuslinse der Laseroptik und damit der Laserspotdurchmesser. Dies bedeutet eine zusätzliche Unsicherheit bei den Messwerten, die es bei der Interpretation von Resultaten zu berücksichtigen gilt. Für die Etablierung der bildgebenden Massenspektrometrie als wissenschaftlicher Zweig und analytisches Werkzeug in der medizinischen Biologie hat sich die Beschaffenheit von Probenoberflächen aber bisher nicht als große Hürde herausgestellt.

Eine Frage der Perspektive

Bildgebende Massenspektrometrie ist an sich eine Methode zur Oberflächenanalyse. Massenspektren werden durch diskrete oder kontinuierliche Rasterung der Proben-oberfläche im räumlichen Zusammenhang gewonnen und anschließend entsprechend der analytischen Fragestellung ausgewertet. In sogenannten  ion maps wird die räumliche Verteilung einzelner Masse-zu-Ladung-Verhältnisse visualisiert. Tatsächlich wird, zumindest im biologischen Kontext, aber oft eine Fragestellung untersucht, die mit einer volumetrischen Verteilung assoziiert ist (Abb. 1). Eine klassische Anwendung wäre hier zum Beispiel, wie sich ein Krebstumor – ein Zellhaufen mit dreidimensionaler Ausdehnung – in seinem Metabolismus vom umliegenden Gewebe unterscheidet. Der einfachste Weg beide Gewebetypen miteinander zu vergleichen ist, dünne Gewebeschnitte anzufertigen, die teils mi-kroskopisch mit Färbemethoden und teils massenspektrometrisch analysiert werden können. In der neusten Generation kommerzieller Geräte ist daher der Probendurchsatz ein entscheidendes Kriterium in der Entwicklung, um den zeitlichen Aufwand einen kompletten Tumor zu vermessen, minimal zu halten und das analytische Volumen in seiner Gänze auszunutzen.

Das Verfahren stößt allerdings an seine Grenzen, wenn die biologisch-analytische Fragestellung mit einer Fläche anstatt mit einem Volumen assoziiert ist. Ein einfaches Beispiel ist die Verteilung von spezialisierten Metaboliten in einem Pflanzenblatt, nachdem dieses von einem Fraßfeind verletzt wurde (Abb. 2). Prinzipiell ließe sich das Blatt in viele Schnitte zerlegen und das gesamte Volumen vermessen, allerdings wird so aus einer einzelnen Probenoberfläche ein ganzer Stapel von Flächen. Zusätzlich könnte das Zerschneiden des Blattes ähnliche Vorgänge wie die mechanische Beschädigung durch den Fraßfeind auslösen und so das Ergebnis verfälschen. Analysiert man stattdessen das ganze Blatt, muss nur eine einzige
Probenoberfläche analysiert werden. Die Beschaffenheit der Blattoberfläche wird dann allerdings ein bestimmender Parameter der Datenqualität. Je komplexer die Topografie des zu analysierenden Bereiches ist, desto schwieriger wird die Gewinnung qualitativ hochwertiger Daten.

Wie bereits angedeutet hat der Abstand der Fokuslinse zur Probenoberfläche weitreichenden Einfluss auf die Größe des Laserspots und damit auf das analysierte Probenvolumen. Für die erfolgreiche und reproduzierbare Analyse von Proben mit komplexer Oberflächenbeschaffenheit ist es daher von entscheidender Bedeutung diesen Parameter zu kontrollieren. Bisherige Lösungsansätze, die Einflüsse der Oberflächenbeschaffenheit zu minimieren, nahmen dafür Einschnitte in der räumlichen Auflösung in Kauf, zum Beispiel, indem bei Laser-basierten Ionenquellen Fokuslinsen mit sehr großen Brennweiten und entsprechend verminderter Fokussierung eingesetzt wurden. In neuen Lösungsansätzen wird nun versucht, Unebenheiten der Probenoberfläche durch an die örtliche Topografie angepasste Gegenbewegungen auszugleichen.

Hindernis Topografie

Damit dieser Ansatz funktioniert, muss die örtliche Topografie der Probenoberfläche vor dem eigentlichen Ionisierungsexperiment vermessen worden sein. Unter dem Oberbegriff der Profilometrie lässt sich eine Reihe von Messmethoden zusammenfassen, die darauf abzielen, die Beschaffenheit einer Oberfläche zu erfassen. So wie alle etablierten Messwissenschaften hat auch die Profilometrie über die Jahre eine Vielzahl an Messprinzipien und deren Realisierungen hervorgebracht. Diese lassen sich grob in die etwas länger bekannten Sonden-vermittelten und die neueren optischen Methoden unterteilen.

Sonden-vermittelte Profilometrie bedeutet das Abrastern einer Fläche mit empfindlichen physikalischen Sonden, welche sich konstant in einem Bereich von wenigen Mikrometern zur Probenoberfläche befinden bzw. physischen Kontakt zur Oberfläche herstellen müssen. Alternativ, je nach Wahl der Sonde, kann die Messung auch mittels verschiedener spektroskopischer Methoden erfolgen, die nicht nur eine Erfassung topografischer, sondern auch chemischer oder elektro-magnetischer Informationen erlauben. Viele dieser spektroskopischen Messungen verlangen einen konstanten Abstand zur Probenoberfläche, was die Kombination mit profilometrischen Methoden ideal macht. In der Material- und Polymerforschung, in der auch die bildgebende Massenspektrometrie in den 1960er Jahren ihr Debut gab [6], ist diese Art der Oberflächencharakterisierung fester Stoffe weit verbreitet und es ist daher nicht verwunderlich, dass erste Versuche, die  Profilometrie mittels Rasterkraftmikroskopie und Massenspektrometrie zu kombinieren, in diesem Kontext stattfanden [7–9].

Im Hinblick auf die laterale Auflösung und Messpräzision ist die Sonden-vermittelte Profilometrie den  optischen Methoden technisch immer noch überlegen. Systematisches Abrastern größerer Flächen mit empfindlichen, physikalischen Sonden ist allerdings ein zeitaufwendiges Unterfangen. Zusätzlich schränkt die Instrumentation, welche den hohen Grad an Präzision Sonden-vermittelter Profilometrie erlaubt, den dynamischen Bereich der topografischen Messung stark ein. Eine Anwendung an  unebenen biologischen Proben erweist sich daher als schwierig.

In einer kürzlich veröffentlichten Studie [10] wurde erstmals die Kombination einer Scherkräfte-messenden Rastersonde mit bildgebender Massenspektrometrie von unebenen biologischen Proben vorgestellt. Es gelang die Analyse bakterieller Kolonien mit Unterschieden von bis zu 800 µm im Höhenprofil der Kolonieoberfläche.  Die von den Forschern angewandte Ionisierungsmethode NanoDESI (Desorption-Elektrospray-Ionisierung) extrahiert Analyten mittels einer Lösungsmittelbrücke, die über die Probenoberfläche gezogen wird, und führt diese per Elektrospray einem Massenspektrometer zu. Kenntnis über die Topografie der Probe ist dabei von entscheidender Bedeutung, um die Kontaktfläche zwischen Probenoberfläche und Lösungsmittelbrücke konstant zu halten, damit ein Aufsetzen des Kapillarsystems vermieden wird. Die entscheidende Neuerung in der beschriebenen Ionenquelle ist die Beprobung der Lösungsmittelbrücke mit der Scherkräfte-messenden Rastersonde. Änderungen der Kontaktfläche können so unmittelbar detektiert und ausgeglichen werden. Neben den relativen Höhenunterschieden in der Topografie einer Probenoberfläche ist aber auch die Geometrie einzelner Oberflächenmerkmale zu beachten. Bakterielle Kolonien zeichnen sich durch eine verhältnismäßig einfache Oberflächenstruktur aus. Bei Tieren und Pflanzen kann die Oberfläche zusätzlich noch komplexere Geometrien, wie Spalten, Stufen oder Haare, aufweisen. An dieser Stelle stoßen Messsonden oft an ihre Grenzen, da sich ungewollte physische Kollisionen mit der Probenoberfläche kaum noch vermeiden lassen.

Der Abstandssensor eines optischen Profilometers hingegen kann sich Zentimeter von der zu vermessenden Probenoberfläche entfernt befinden. Eine physische Beeinflussung der Probe durch die profilometrische Vermessung ist daher ausgeschlossen. Plötzliche Änderungen in der Oberflächenbeschaffenheit können optische Sensoren dennoch beeinflussen. Insbesondere Sensoren, die auf dem Prinzip der Lasertriangulation beruhen, strahlen Licht in Winkeln kleiner als 90° auf die Oberfläche ein, wodurch im Fall von stark bewegten Oberflächen Bereiche entstehen können, die im „Schatten“ anderer Oberflächenmerkmale liegen und sich so der Vermessung entziehen. Sensoren, die den Abstand mit orthogonal einfallendem Licht messen, weisen auf diesem Gebiet eine höhere Toleranz auf. Ein erster Versuchsaufbau, der diese Art der Profilometrie mit Laserablation-Elektrosprayionisierung (LAESI) verbindet, wurde ebenfalls kürzlich vorgestellt [11].  Im Speziellen wurden die Vorteile orthogonaler optischer Profilometrie und Infrarot-Laserablation bei der Beprobung von extremen Oberflächengeometrien, wie beispielsweise einer Stufe, untersucht. Höhenprofile von Pflanzenblättern mit einer lateralen Auflösung von 200 µm bis 10 µm wurden mithilfe des orthogonalen Profilometers ermittelt. Diese Höhenprofile wurden verwendet, um auf Blattoberflächen mit Höhenunterschieden von bis zu 1400 µm Stoffwechselprodukte zu identifizieren und sichtbar zu machen (metabolic profiling / imaging). Dies zeigt, dass optische Profilometer orthogonaler Bauweise ein Auslesen der Probenoberfläche über einen weiten, vertikalen Bereich ermöglichen, ohne allerdings die Probe an sich zu beeinflussen, und damit das Feld bildgebender Massenspektrometrie mit hoher lateraler Auflösung auch für topografisch anspruchsvolle Proben öffnen.

Wohin die Reise geht…

Der Trend zu immer höheren lateralen Auflösungen mit Schrittweiten von 1 µm und kleiner wird auch bei Gewebeschnitten und anderen Proben, die derzeit als flach gelten, die Oberflächentopografie zunehmend an Bedeutung gewinnen lassen. Schon jetzt wird die Frage nach Möglichkeiten zur absoluten Quantifizierung laut. Von essentieller Bedeutung für die Qualität und Reproduzierbarkeit der Messergebnisse ist hierbei die Kontrolle über das analysierte Volumen. Die angemessen kontrollierte Laser-Fokussierung ist eine Voraussetzung, die die Quantifizierung von Metaboliten erst möglich macht. Eine nachträgliche Korrektur, wie sie bislang angewandt werden musste, um einen ungeeigneten Laser-Fokus zu korrigieren, würde dann überflüssig werden.  Dieser Aspekt wurde von einem Großteil der Anwender bildgebender Massenspektrometrie bislang vernachlässigt; in den nächsten Jahren wird er jedoch weithin anerkannt werden und Lösungen zur Oberflächenkorrektur werden sich durchsetzen.

In der Zukunft könnten topografische Oberflächenmessungen sogar mit der Desorption kombiniert werden.  Dafür könnte der gleiche Laser für Messungen der Topografie verwendet werden, obgleich er auf einem Energieniveau unterhalb der Desorptionsschwelle abgefeuert werden müsste. Dies würde eine Linse mit multi-optischen Elementen und einem verstellbaren Fokus erfordern, sowie einen Detektor für zurückgestreutes Licht. Mit solchen Lösungen kann die moderne Anwendung von bildgebender Massenspektrometrie in die reale Welt gebracht werden und weist den Weg in die Zukunft: die Entwicklung transportabler und/oder sogar tragbarer Geräte. Auf diese Art wird quantitatives profiling und imaging, beispielsweise für die Erfassung spezialisierter Metaboliten oder in der Nahrungsmittelkontrolle, an natürlichen Proben machbar – einschließlich solchen mit bislang methodisch nur schwer zugänglichen, topografisch anspruchsvollen Oberflächen.
 

Autoren
Benjamin Bartels1 und Aleš Svatoš1

Zugehörigkeit
1Forschungsgruppe Massenspektrometrie, Max-Planck-Institut für chemische Ökologie, Jena, Deutschland

Kontakt  
Dr. Aleš Svatoš
Gruppenleiter
Forschungsgruppe Massenspektrometrie
Max-Planck-Institut für chemische Ökologie
Jena, Deutschland
svatos@ice.mpg.de

Lebenslauf
Aleš Svatoš
leitet seit 15 Jahren die Forschungsgruppe für Massenspektrometrie am Max-Planck-Institut für chemische Ökologie (MPI-CE). Nach Studium und  Promotion in Organischer und Analytischer Chemie am Institute of Chemical Technology, Prag, folgte weitere Forschungstätigkeit in Strukturaufklärung und Biosynthese von Naturstoffen als Stipendiat der Tschechoslowakischen Akademie der Wissenschaften, der Cornell University und der Alexander von Humboldt Stiftung. In seiner Funktion am MPI-CE ist er maßgeblich an der Erforschung der chemischen Grundlagen von Kommunikation im Tier- und Pflanzenreich beteiligt.

Lebenslauf
Benjamin Bartels

absolvierte ein Studium in Biologie und analytischer Chemie an der ETH Zürich. Im Rahmen seiner Doktorarbeit am Max-Planck-Institut für chemische Ökologie erforscht er seit 2015 bildgebende Verfahren in der Massenspektrometrie, die eine Charakterisierung spezialisierter Metaboliten und deren räumliche Verteilung ermöglichen. Im Fokus steht die Erschließung von Proben, welche sich bisher einer routinierten Analyse entziehen und daher die Erforschung von Kommunikation zwischen Pflanzen und ihren Interaktionspartnern auf molekularer Ebene erschweren.
 

Referenzen
[1] Fenn J, Mann M, Meng C, Wong S, Whitehouse C. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science 1989;246:64–71. doi:10.1126/science.2675315.
[2] Karas M, Hillenkamp F. LASER DESORPTION IONIZATION OF PROTEINS WITH MOLECULAR MASSES EXCEEDING 10000 DALTONS. AnalyticalChemistry 1988;60:2299–2301. doi:10.1021/ac00171a028.
[3] Spengler B, Hubert M, Kaufmann R. MALDI Ion Imaging and Biological Ion Imaging with a new Scanning UV-Laser Microprobe. Proceedings of the 42nd Annual Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 1994, p. 1041.
[4] Stoeckli M, Farmer TB, Caprioli RM. Automated mass spectrometry imaging with a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight instrument. Journal American SocietyMassSpectrometry 1999;10:67–71. doi:10.1016/S1044-0305(98)00126-3.
[5] Heeren RM, Smith DF, Stauber J, Kükrer-Kaletas B, MacAleese L. Imaging mass spectrometry: hype or hope? Journal American SocietyMassSpectrometry 2009;20:1006–1014. doi:10.1016/j.jasms.2009.01.011.
[6] Liebl H. Ion microprobe mass analyzer. Journal Applied Physics 1967;38:5277–5283. doi:http://dx.doi.org/10.1063/1.1709314.
[7] Nudnova MM, Sigg J, Wallimann P, Zenobi R. Plasma Ionization Source for Atmospheric Pressure Mass Spectrometry Imaging Using Near-Field Optical Laser Ablation. AnalyticalChemistry 2015;87:1323–1329. doi:10.1021/ac504039w.
[8] Ovchinnikova OS, Nikiforov MP, Bradshaw JA, Jesse S, Van Berkel GJ. Combined atomic force microscope-based topographical imaging and nanometer-scale resolved proximal probe thermal desorption/electrospray ionization–mass spectrometry. AcsNano 2011;5:5526–5531. doi:10.1021/nn200939e.
[9] Ovchinnikova OS, Tai T, Bocharova V, Okatan MB, Belianinov A, Kertesz V, et al. Co-registered Topographical, Band Excitation Nanomechanical, and Mass Spectral Imaging Using a Combined Atomic Force Microscopy/Mass Spectrometry Platform. ACSnano 2015;9:4260–4269. doi:10.1021/acsnano.5b00659.
[10] Nguyen SN, Liyu AV, Chu RK, Anderton CR, Laskin J. Constant-Distance Mode Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging of Biological Samples with Complex Topography. AnalyticalChemistry 2016. doi:10.1021/acs.analchem.6b03293.
[11] Bartels B, Kulkarni P, Danz N, Böcker S, Saluz HP, Svatoš A. Mapping metabolites from rough terrain: laser ablation electrospray ionization on non-flat samples. RSCAdvances 2017;7:9045–9050. doi:10.1039/C6RA26854D.

 

Weitere Beiträge zu Massenspektrometrie

Mehr Quo Vadis Artikel

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.