Probenvorbereitung und Automation

Aller Anfang ist schwer

  • Abb. 1: Systemaufbau der Online-SPE-LC-MS/MS-Kopplung: 1) HPLC Pumpe, 2) PAL RTC Probengeber, 3) automatischer Kartuschenwechsler, 4) High Pressure Dispenser (HPD) 5) HPLC Ofen, 6) Tandemmassenspektrometer.Abb. 1: Systemaufbau der Online-SPE-LC-MS/MS-Kopplung: 1) HPLC Pumpe, 2) PAL RTC Probengeber, 3) automatischer Kartuschenwechsler, 4) High Pressure Dispenser (HPD) 5) HPLC Ofen, 6) Tandemmassenspektrometer.
  • Abb. 1: Systemaufbau der Online-SPE-LC-MS/MS-Kopplung: 1) HPLC Pumpe, 2) PAL RTC Probengeber, 3) automatischer Kartuschenwechsler, 4) High Pressure Dispenser (HPD) 5) HPLC Ofen, 6) Tandemmassenspektrometer.
  • Abb. 2: Fließschema für die Nutzung des Online-SPE-Systems:  a) Probenanreicherung und b) Elution.
  • Abb. 3: Aufbau eines kompakten zweidimensionalen HPLC-Systems inklusive Injektionseinheit, Ventilschaltungen und Pumpen.
  • Abb. 4: Schematische  Darstellung zum modularen Aufbau des geplanten  Chromatographie-Chips.
Die Analyse einer Probe mittels Flüssigkeitschromatographie ist nur einer der letzten Schritte innerhalb des gesamten Probenzyklus. Je nach Art und Beschaffenheit der Probe ist es zwingend notwendig, mehr oder weniger aufwendige Probenvorbereitungsmaßnahmen durchzuführen. Dies schließt häufig eine Aufreinigung und / oder Anreicherung ein.
 
In Zeiten steigender Personalkosten und des generellen Trends zur Effizienzsteigerung, sind Verfahren zur automatisierten Probenvorbereitung, wie z. B. die Online Festphasenextraktion (Online-SPE), eine attraktive Alternative, den Probendurchsatz zu erhöhen und die Analysenkosten zu reduzieren. Dass auch hier die Miniaturisierung einen deutlichen Vorteil gegenüber klassischen Verfahren bieten kann, wollen wir im Folgenden erläutern.
 
Probendurchsatz
 
Die Erhöhung des Probendurchsatzes ist in allen Bereichen der analytischen Chemie und Life Sciences ein Kriterium, dem hohe Priorität eingeräumt wird. In vielen Fällen wird dabei „nur“ der Schritt der eigentlichen Analyse mittels z. B. HPLC-UV oder HPLC-MS gesehen und der Probendurchsatz lediglich anhand dieses Arbeitsschritts korreliert. Von der Probenahme einmal abgesehen, benötigen die übrigen Arbeitsschritte wie Vorbereitung der Probe, Auswertung der Ergebnisse, Plausibilitätskontrolle und Berichtserstellung deutlich mehr Zeit. Insofern ist es sinnvoll, immer den Gesamtprozess zu betrachten. Die Automatisierung liefert hier einen wertvollen Beitrag, entweder den Probendurchsatz zu erhöhen, oder personalintensive Arbeitsschritte in Zeitbereiche zu legen, die i. d. R. ungenutzt bleiben. Dies schließt u. a. Nacht- oder Wochenendzeiten ein, in denen der Laborbetrieb in vielen Fällen ruht oder zumindest stark eingeschränkt ist.
 
Online-SPE
 
Ein Aufbau, der eine vollautomatisierte Probenvorbereitung inklusive Aufreinigung und Anreicherung erlaubt, ist in 
Abbildung 1 wiedergegeben. Hierbei handelt es sich um eine Online-SPE, die mit einem HPLC-MS/MS-System gekoppelt ist. Das System besteht aus einem „Prep and Load Robotic Tool Change“ (PAL RTC) Probengeber mit einer 100 µL, 1 mL und 10 mL Spritze, zwei Injektionsventilen mit unterschiedlichen Probenschleifen und einer Anreicherungseinheit für die automatisierte Online-SPE mit einem Kartuschenwechsler. Die erste Probenschleife hat ein Volumen von 50 µL, sodass das System als reines HPLC-System mit der Möglichkeit zur Aufgabe kleiner Probenvolumina genutzt werden kann. Die zweite Probenschleife hat ein Volumen von 10 mL. Hiermit erfolgt die Anreicherung der Probe auf einer auswechselbaren SPE-Kartusche. Optional können 
z. B. Waschschritte vorgenommen werden, um Salze zu entfernen. Wie anhand des Aufbaus ersichtlich wird, muss eine größere Laborfläche freigehalten werden. Des Weiteren ist deutlich zu erkennen, dass relativ komplexe Ventilschaltungen und Transferwege notwendig sind. Trotz der langen Kapillarwege ist das experimentell bestimmte Systemvolumen mit 350 µL moderat.
 
2D-Mikro-LC
 
Die in Abbildung 1 dargestellte Konfiguration kann prinzipiell auch als zweidimensionales HPLC-System aufgefasst werden, indem die SPE-Kartusche nicht nur für die Anreicherung bzw. Aufreinigung eingesetzt, sondern auch für eine Vortrennung genutzt wird, wenn eine SPE-Kartusche mit orthogonaler Selektivität im Vergleich zur HPLC-Säule verwendet wird. Darüber hinaus können auch zwei SPE-Kartuschen seriell miteinander gekoppelt werden, um z. B. eine Normalphase mit einer Umkehrphase zu kombinieren. Mittels Pfropfenelution lässt sich eine organische Elution von einer SPE-Kartusche realisieren. Über eine Hilfspumpe oder, wie bei dem in Abbildung 1 gezeigten Aufbau über den High Pressure Dispenser (HPD), kann der organische Pfropfen dann wieder wässrig verdünnt werden, um eine Fokussierung der Probe auf der analytischen Säule zu gewährleisten. In Abbildung 2 sind exemplarisch zwei Flusswege für die Probenanreicherung sowie die Elution dargestellt.
 
Im Bereich der miniaturisierten zweidimensionalen HPLC gibt es auch bereits erste Ansätze, die Pumpen und Injektion inklusive der Schaltventile in einem kompakten Aufbau zu realisieren (Abb. 3).
 
Ein kritischer Punkt ist hierbei die Verbindung der Säule mit dem Emittertip des Massenspektrometers. Wie aus 
Abbildung 3 ersichtlich ist, wird eine etwa 25 cm lange Kapillarverbindung benötigt. Insbesondere diejenigen Volumina hinter der Trennsäule tragen in entscheidendem Maße zur Bandenverbreiterung bei, da die chromatographischen Banden vor Eintritt in das Massenspektrometer nicht mehr refokussiert werden können. Nichtsdestotrotz kann die benötigte Laborfläche im Vergleich zu dem in Abbildung 1 dargestellten Aufbau deutlich reduziert werden. Die optimale Lösung in Bezug auf den Platzbedarf stellt allerdings die Übertragung der zweidimensionalen Trenneinheit auf einen Chip dar, der dann direkt vor der Einlassquelle des Massenspektrometers positioniert werden kann. Ein Aufbau dieser Art umgeht das Problem der externen Bandenverbreiterung und stellt demzufolge die bestmögliche Kopplungsmöglichkeit zwischen Chromatographie und Detektion dar.
 
Es geht noch kleiner
 
Aktuelle Ansätze aus der Forschung zielen darauf ab, nicht nur die zweidimensionale Trenneinheit auf Chipgröße zu schrumpfen, sondern auch Probenvorbereitungsschritte zu integrieren. Ein solches Design ist in Abbildung 4 gezeigt. Die Etablierung eines solchen Ansatzes würde zu einer enormen Reduzierung der benötigten Laborfläche führen.
 
Der mikrofluidische Chip ist prinzipiell aus zwei mikrostrukturierten Ebenen mit Kavitäten und Kanälen aufgebaut, die als Reservoire und im zusammengefügten Zustand auch als Flusskanäle dienen. Durch das gegeneinander Verschieben dieser Ebenen können durch Ergänzung von Strukturen in der oberen und unteren Ebene Mikrokavitäten vereinigt und wieder verschlossen sowie mikrofluidische Fließwege generiert, geöffnet und abgesperrt werden. Dieser Ansatz ist als äußerst vielversprechend und innovativ anzusehen, da er ohne die Verwendung chipintegrierter Ventile auskommt und damit ein erhöhtes Maß an Robustheit verspricht. Darüber hinaus ist es mit dieser Chiparchitektur möglich, die Injektion auf dem Chip, also On-Chip, durchzuführen und eine totvolumenarme Verbindung zwischen den beiden chromatographischen Trenndimensionen zu realisieren. Nicht verschwiegen werden darf, dass die Miniaturisierung der Trenneinheit nur ein einziger Baustein auf dem Weg zu portablen Systemen ist. Um das Ziel der Gesamtminiaturisierung zu erreichen, müssen sämtliche Peripheriebestandteile wie z. B. Pumpen und Detektoren ebenfalls verkleinert werden.
 
Fazit
 
Trotz der enormen Vorteile, die die Chip-Technologie bietet, ist es immer noch ein langer Weg von der Forschung in die Routine. Die wirkliche Stärke miniaturisierter integrierter Systeme ist sicherlich darin zu sehen, alle Komponenten, wie Probenaufreinigung, ein- oder zweidimensionale Chromatographie und ggf. weitere Funktionalitäten wie z. B. die Integration von Misch- oder Hilfskanälen zur Einspeisung von Ionisationshilfsmitteln für die sensitive massenspektrometrische Detektion, auf einem einzigen Chip zu vereinen.
 
Danksagung
 
Das IGF-Projekt 18199 BG mit dem Titel „Entwicklung eines mikrofluidischen SlipChips zur schnellen Analyse komplexer Stoffgemische mittels online Anreicherung und zweidimensionaler Nano-Flüssigkeitschromatografie“ der Forschungsvereinigung DECHEMA wird über die AiF im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.
 
Haben Sie Fragen zur Anwendung und Technik im Bereich Mikro-LC und 2D-LC? Fragen Sie die Experten vom IUTA: adlichrom@iuta.de
 
Möchten Sie mehr zum Thema Mikro-LC lernen? Schauen Sie sich das Projekt "Fortschrittliche Chromatographie" an.
 
Grundlagen der Mikro-LC finden Sie kompakt in der Chemgapedia Lerneinheit Mikro-LC.
 
Grundlagen der 2D-LC finden Sie in der Chemgapedia Lerneinheit 2D-LC
 
Autoren: Thorsten Teutenberg, Terence Hetzel, Denise Loeker, Juri Leonhardt
 
Kontakt  
Dr. Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und 
Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Bereichsleiter Forschungsanalytik
Duisburg, Deutschland
adlichrom@iuta.de
 

 

Kontaktieren

Microsite Fortschrittliche Chromatographie


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