Chromatographiedatensysteme für Makromoleküle

Korrekte Ergebnisse mit Ausgabe der Messunsicherheit

  • Abb. 1: Vergleich Chromatogramm mit einge- blendeter Kalibrationskurve (unten) mit Mol- massenverteilung (oben) für 7 unterschiedli- che MolmassenAbb. 1: Vergleich Chromatogramm mit einge- blendeter Kalibrationskurve (unten) mit Mol- massenverteilung (oben) für 7 unterschiedli- che Molmassen
  • Abb. 1: Vergleich Chromatogramm mit einge- blendeter Kalibrationskurve (unten) mit Mol- massenverteilung (oben) für 7 unterschiedli- che Molmassen
  • Abb. 2: Vergleich der korrekt ermittelten Molmassenverteilung (grün) in einem MCDS mit dem  Molmassendiagramm (rot). Trotz sehr ähnlicher Mittelwerte sind die Abweichungen bei Fraktio- nen (vgl. untere blaue Hervorhebung) deutlich.
  • Abb. 3: Ergebnisse einer GPC/SEC-Messung  mit Angabe der Messunsicherheit
  • Abb. 4: Analyse der Beiträge zur Messunsi- cherheit. Hier resultiert der größte Fehler aus  der nicht ausreichenden Kalibrationsqualität  gefolgt von der Signalqualität.
  • Abb. 5: Vergleich eines guten UV-Signals (grau, geringe Messunsicherheit) mit einem RI-Signal  (rot) mit geringer Signalstabilität und damit hoher Messunsicherheit der Ergebnisse.

Selbst Analytikern mit umfangreichen Erfahrungen im Bereich HPLC und GC bereitet die Analytik von Makromolekülen sowie die Beurteilung der Ergebnisse oft Schwierigkeiten. Der Einsatz einer spezifischen Softwarelösung, optimiert für die besonderen Anforderungen der makromolekularen Analytik, ist ein Schlüssel zu robusten, aussagekräftigen, vergleichbaren und reproduzierbaren Ergebnissen.

Makromoleküle werden in allen Bereichen des täglichen Lebens eingesetzt. In unterschiedlichsten Branchen, von der Automobilindustrie über das Baugewerbe und die Lebensmittelproduktion, bis hin zur Medizintechnik und Elektronik. Diese Entwicklung kann man darauf zurückführen, dass sich die Produkteigenschaften von Makromolekülen sehr gezielt einstellen lassen. Dies führt auch dazu dass z.B. die Pharmaindustrie ihre Forschungsaktivitäten auf Makromoleküle („Biologics“) konzentriert.

Makromoleküle sind von Natur aus komplexe Moleküle. Es liegen generell Mischungen aus verschiedenen Molmassen vor. Je nach Produkt kommen noch weitere Unterschiede in der Zusammensetzung, der Struktur oder den Endgruppen dazu. Aussagekräftige Methoden zur Charakterisierung von Makromolekülen vereinen deshalb die Trennmöglichkeiten einer fraktionierenden (flüssigchromatographischen) Methode mit denen der intelligenten Detektion. Neben Gelpermeationschromatographie (GPC, bzw. size-exclusion chromatography, SEC, genannt) werden in den letzten Jahren auch Wechselwirkungschromatographie (Polymer-HPLC, LAC) sowie 2D-Kopplungen eingesetzt. Als Detektoren werden Konzentrationsdetektoren (Brechungsindex, RI, UV oder ELSD) verwendet, in der F&E zusätzlich oft auch noch on-line Lichtstreudetektoren, Viskosimeter oder Massenspektrometer für die Bestimmung der wahren Molmassen oder Strukturen [1]. Anders als bei der Charakterisierung von niedermolekularen Stoffen müssen bei der Arbeit mit Makromolekülen also spezielle Methoden mit ihren ganz eigenen Abläufen, Ergebnissen, Ergebnisdarstellungen und Fehlertoleranzen angewendet werden.

Korrekte Molmassenverteilungen
Die Evaluierungen von GPC/SEC-Daten unterscheiden sich grundlegend von denen der HPLC oder GC.

Bei HPLC/GC-Datenprozessierung werden primär Peakreihenfolge und Peakfläche zur Auswertung herangezogen. Aus der gemessenen Fläche werden mit Hilfe einer Detektorkalibration Konzentrationen bestimmt. Bei der GPC/SEC-Datenprozessierung werden hingegen die absolute Lage und die Form der Peaks ausgewertet.

Der GPC/SEC-Datenerfassungsprozess liefert als primäre Information (Rohdaten) apparente Konzentrationsverteilungen (Chromatogramm, c(V)), die Informationen der zu untersuchenden Probe aber auch des Mess-Systems enthalten. Erst mit Hilfe einer Kalibration werden aus den primären Informationen die molekularen Probeneigenschaften, z.B. die Molmassenverteilung, bestimmt [2]. Die korrekte Bestimmung der Molmassenverteilung ist wichtig, da nur diese umfassende molekulare Information der Makromoleküle enthält. Im Gegensatz zu den ursprünglichen Chromatogrammen ist hier die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen verschiedenen Messstellen gegeben. Der Unterschied zwischen Molmassenverteilung und Chromatogramm lässt sich leicht verdeutlichen: wird die gleiche Probe in zwei Laboratorien auf unterschiedlichen Instrumenten mit unterschiedlich langen Säulen gemessen, so unterscheiden sich die beiden Chromatogramme. Die korrekt bestimmten Molmassenverteilungen der Proben unterscheiden sich hingegen nicht, denn diese enthalten keine Informationen mehr über das Mess-System. Dadurch erlauben Molmassenverteilungen eindeutigere und unverfälschte Aussagen und bieten einen direkten Vergleich von Produkteigenschaftsprofilen [3].

Notwendige Voraussetzung für die Transformation des Chromatogramms in eine Molmassenverteilung ist die Information über den Molmassenverlauf mit dem Elutionsvolumen Ve (Kalibrationskurve). Diese Information muss gemessen werden. Entweder indem man mittels Referenzmaterialien mit bekanntem Molmassenmittelwerten deren Elutionsvolumina misst und eine externe Kurve erzeugt oder indem man mit Hilfe eines on-line Lichtstreudetektors die Molmasse direkt bestimmt und damit online die Kalibrierkurve erzeugt. Bei beiden Verfahren existieren für viele Applikationen (speziell im Bereich der Copolymeranalytik) deutliche Einschränkungen bezüglich der Genauigkeit der Molmassenwerte. Diese sind in der Literatur ausführlich beschrieben [4].

Eine korrekte Transformation führt in der Regel dazu, dass sich die Peakformen im Chromatogramm von denen der Molmassenverteilung unterscheiden [3]. Abb. 1 zeigt diesen Effekt besonders gut bei Peaks 4 und 5, die im Chromatogramm (untere Abbildung) fast die gleiche Höhe besitzen. In der Molmassenverteilung (obere Abbildung) ist Peak 5 hingegen deutlich kleiner (da er einen etwas größeren Molmassenbereich umfasst). Welchen Einfluss die Kalibration auf die Peakbreite hat, ist bei dem Peakpaar 5 und 6 zu erkennen. Obwohl im Chromatogramm beide Peaks fast die gleiche Breite besitzen, sind sie in der MWD Darstellung sehr unterschiedlich hoch und breit, da Peak 6 eine viel breitere Molmassenverteilung aufweist.

Leider wird diese Transformation in vielen kommerziellen, für die HPLC und GC von niedermolekularen Verbindungen entwickelten Chromatographiedatensystemen (CDS) nicht umfassend durchgeführt. In diesem Fall werden dann die Probenanteile unterhalb bzw. oberhalb einer Molmassengrenze falsche Ergebnisse zeigen. Dies ist z.B. bei Produkt-anmeldungen problematisch, da viele Zulassungsbehörden die Angabe von Produktanteilen kleiner 500 g/mol bzw. kleiner 1000 g/mol verlangen. In den letzten Jahren wurden zudem vermehrt Angaben zur integralen Verteilung verlangt, die ebenfalls nur aus einer Molmassenverteilung bestimmt werden können. Aus der Richtigkeit der Molmassenmittelwerte, lassen sich keine Rückschlüsse daraus ziehen, ob in einem Datensystem korrekte Molmassenverteilungen angezeigt werden. Da Molmassenmittelwerte fast ausschließlich über die Streifenmethode bestimmt werden, können in einer Software korrekte Molmassenmittelwerte neben falschen Molmassenverteilungen erhalten werden. Hier müssen Anwender selbst validieren bzw. die Richtigkeit aller Ergebnisse nachvollziehen [3].

Abb. 2 zeigt das Resultat für die Freigabe einer Heparin Probe, die als Anti-Thrombose Mittel eingesetzt wird. Für die korrekte Unterdrückung der Blutgerinnung sind die korrekten Molmassen (Mw) und Molmassenanteile (w < 2000 Da und w < 8000 Da) sehr wichtig und daher auch eng in den Arzneibüchern spezifiziert. Die GPC/SEC Datenerfassung und –analyse wurde gemäß internationaler Normen durchgeführt (grüne Verteilungskurve in Abb. 2), die rote Kurve zeigt die Ergebnisse einer HPLC Software. Obwohl die Molmasse Mw sich in beiden Fällen nicht signifikant unterscheidet, unterscheiden sich die Freigabewerte für die hoch- und niedermolekularen Anteile, die ein wirksames Produkt enthalten darf, deutlich.

Das obige Beispiel zeigt, wie kompliziert es im Einzelfall ist, richtige von falschen Ergebnissen zu unterscheiden.

Bestimmung der Messunsicherheit
Exakt richtig zu messen ist grundsätzlich nicht möglich. Es gibt viele Parameter, die durch statistische Fehler beeinträchtigt werden und die finale Qualität der Ergebnisse beeinflussen. Wie bei allen Methoden, gibt es auch bei der GPC/SEC eine Messunsicherheit, die der Anwender kennen sollte, um beurteilen zu können, ob z.B. zwei Proben identisch sind oder nicht. Wichtig ist aber zu bedenken, dass jegliche Software nur mit zufälligen Fehlern umgehen kann. Systematische Fehler, die spezifisch für die Benutzerumgebung sind, können hier nicht mit erfasst werden. Um Proben derselben Methode beurteilen zu können, reicht eine Bestimmung der Messunsicherheit aber durchaus.

Da bei chromatographischen Systemen viele Fehlerquellen zur Gesamtabweichung vom wahren Wert beitragen, müssen umfangreiche Fehlerfortpflanzungsberechnungen durchgeführt werden, um eine zuverlässige Abschätzung der Unsicherheit der Endergebnisse zu erhalten. Im Falle von GPC/SEC-Daten von Makromolekülen tragen die Basislinienqualität, Rauschen und Drift von Detektorsignalen, sowie Kalibrationsart und deren Qualität im Wesentlichen zur Messunsicherheit bei. Ebenfalls eine große Rolle spielt die Stabilität und Robustheit des GPC/SEC-Systems, die sich im Wesentlichen mit der Auswahl/Beschaffung geeigneter Komponenten und die Wartung/Qualifizierung unter GPC-Messbedingungen verbessern lassen.

Ein Makromolekulares MCDS führt für alle Daten automatisch im Hintergrund eine Präzisionsanalyse und –berechnung durch. Die Messunsicherheit kann zusätzlich zu allen Ergebnissen optional ausgegeben werden. Dadurch ist es möglich GPC/SEC-Ergebnisse besser zu beurteilen.

Liegen für Produktstabilitätstests z.B. 2 Messergebnisse der gleichen Probe zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor, die sich im Mw um 2000 Da unterscheiden, dann kann nicht ohne weitere Information festgestellt werden, ob das Produkt sich in diesem Zeitraum verändert hat oder nicht. Mit Hilfe der gemessenen Messunsicherheit kann aber sofort beurteilt werden, ob beide Ergebnisse innerhalb oder außerhalb der Fehlertoleranz der Messmethode bzw. der Einzelmessungen liegen. Abb. 3 zeigt für den Mw Wert eine Messunsicherheit von ca. 18%. Da der Mw-Wert bei der Nachmessung 1 Monat später 2000 Da kleiner war, liegen beide Ergebnisse innerhalb der Fehlertoleranz dieses Messsystems. Im Rahmen der Messgenauigkeit kann also nicht auf einen molekularen Abbau dieses Produktes wäh rend einer kurzfristigen Lagerung geschlossen werden.

Die naheliegende Frage lautet nun: Was kann das Labor tun, um die Ergebnispräzision zu verbessern um auch kleinere Molmassen Unterschiede sicher zu messen?

Auch dazu kann ein geeignetes MCDS nützliche Hinweise geben. z.B. eine Präzisionsanalyse, die versucht, die Fehlerquellen zu quantifizieren (s. Abb. 4), indem sie die wesentlichen Quellen statistischer Ergebnisfehler darstellt. Dieses Werkzeug quantifiziert die wesentlichen Faktoren, die zur Messunsicherheit beitragen: Signalqualität (Rausch, Drift, Wandern, Signal-Rausch-Verhältnis, etc.), Systemstabilität (Flusspräzision, Druck-/Temperatur-Fluktuation, etc.) und Kalibrationsqualität (Abweichung der Kalibrierpunkte vom Fit, kalibrierter Bereich der Probe, etc.). In unserem Beispiel sind die Kalibrationsqualität, gefolgt von der Signalqualität, die wesentlichen Ursachen für die Ergebnisunsicherheit. Die Systemstabilität, als kleiner Beitrag zur Verbesserung der Mess-Präzision, kann hier vernachlässigt werden.

Durch Optimierung der Kalibrationsqualität (Kalibrationsbereich, Anzahl der Kalibrationspunkte, Residuenverteilung) konnte in diesem Fall eine erhebliche Verbesserung der Messunsicherheit erreicht werden. Dadurch sank die Messunsicherheit von ca. 18% auf 5%.

Durch Verbesserung der Signalqualität (z.B Eluentqualität, Pumpenwartung) kann eine weitere Erhöhung der Messpräzision erreicht werden. In Abb. 5 ist die Qualität der Rohsignale gut zu erkennen. Offensichtlich ist das RI-Signal (rote Kurve) instabil und zeigt deutlich höhere Messunsicherheiten als das stabilere UV-Signal (graue Kurve), dessen Ergebnisse auch in der Abbildung zu sehen sind: eine dramatische Verbesserung (ca. 10fach geringerer Fehler) gegenüber dem ursprünglichen Zustand.

Transparenter Datenaustausch
Die Anforderungen an moderne GPC/SEC-Datensysteme umfassen auch den nahtlosen Austausch von Methoden, Ergebnissen und manchmal auch Kopien der Rohdaten. Dabei ist nicht nur wegen der Datenmenge wichtig, dass makromolekulare GPC/SEC Datensysteme offene Schnittstellen zu LIMS und Produkt-Freigabe Systemen bieten. Diese Anforderungen unterscheiden sich nicht grundsätzlich von klassischen CDS Systemen, mit dem wesentlichen Unterschied, dass weitere Parameter wie z.B. Molmassenmittelwerte, und Verteilungsfunktionen ohne manuelle Eingriffe an die Ziel-Datenbanken übertragen werden müssen. Hier wäre im Einzelfall zu prüfen, wie umfassend, einfach und sicher solche Schnittstellen sind.

Kontakt
Peter Kilz
PSS Polymer Standard Service

Literatur

[1] P. Kilz, H. Pasch; Coupled LC techniques in molecular characterization; in: Encyclopedia of Analytical Chemistry; R.A. Myers (ed.); Wiley, Chichester, 2000

[2] GPC/SEC Standard ISO 13885 Part 1 (THF), Part 2 (DMAc), Part 3 (wässrig), International Organization for Standardization, Geneva, 2008

[3] Qualifizierung von GPC/GFC/SEC-Daten und –Ergebnissen, D. Held, P. Kilz, in Chromatogramme richtig integrieren und bewerten,  S. Kromidas, H.-J. Kuss (Ed.), Wiley-VCH, 2008

[4] a) Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography, A. Striegel, W. Yau, J. Kirkland, D. Bly, Wiley & Sons Ltd, 2009

b) Classical Light Scattering from Polymer Solutions, P. Kratochvil, Elsevier, Amsterdam, 1987

c) Kilz, P., Optimierung von GPC/SEC Trennungen, in: HPLC richtig optimiert; S. Kromidas (Ed.), Wiley, Weinheim 2006

[5] P. Kilz, Chromatographia, 59, 3 (2004)

[6] D.Held,P.Kilz, Characterization of Polymers by Liquid Chromatography, Macromolecular Symposia, 231, 145 (2006)

[7] Held D., Kilz P., GPC/SEC as a Key Tool for Assessment of Polymer Quality and Determination of Macromolecular Properties, pp 171-200;  in: Monitoring Polymerization Reactions: From Fundamentals to Applications; Wayne F. Reed, Alina M. Alb (Eds.), Wiley, New York, 2014

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/
Mehr Informationen: http://www.git-labor.de/
Chemgapedia-Lerneinheit(en) zur GPC: http://www.chemgapedia.de/

 

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.