Infektionskrankheiten auf der Spur

Intelligente Software hilft bei der Auswertung zytometrischer Multiplex-Assays

  • Abb. 1: Design eines Bead-basierten Multiplex-Immunoassays für die Durchflusszytometrie. Die Beads werden mit Fängerantikörpern beschichtet, die jeweils spezifisch für ein Analyt sind. Wenn dieses gebunden ist, wird über den sekundären Antikörper ein Antigen-Sandwich aufgebaut.Abb. 1: Design eines Bead-basierten Multiplex-Immunoassays für die Durchflusszytometrie. Die Beads werden mit Fängerantikörpern beschichtet, die jeweils spezifisch für ein Analyt sind. Wenn dieses gebunden ist, wird über den sekundären Antikörper ein Antigen-Sandwich aufgebaut.
  • Abb. 1: Design eines Bead-basierten Multiplex-Immunoassays für die Durchflusszytometrie. Die Beads werden mit Fängerantikörpern beschichtet, die jeweils spezifisch für ein Analyt sind. Wenn dieses gebunden ist, wird über den sekundären Antikörper ein Antigen-Sandwich aufgebaut.
  • Abb. 2: Die im Durchflusszytometer gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Beads werden den Analyten zugeordnet. Gelb markiert sind die Mittelwerte der Populationen.

Multiplex-Assays erlauben die simultane Bestimmung einer Vielzahl von Proteinen in einem Versuchsansatz. Hierbei entstehen vielschichtige Datensätze, die in mehreren manuellen Einzelschritten ausgewertet werden müssen. Dabei hilft spezialisierte Software, welche auf besondere Anforderungen der Analyse von Multiplex-Assays zugeschnitten ist und die Untersuchung komplizierter Fragestellungen vereinfacht.

Das Immunsystem nutzt eine Vielzahl von Signalgebern für die Kommunikation unter Zellen. Bestimmte Botenstoffe lösen spezifische Immun-antworten aus und helfen auf diese Weise dabei Erreger abzuwehren, die in den Körper eindringen. Diese sogenannten Zytokine beeinflussen die Ausdifferenzierung von Immunzellen. Eine bestimmte Kombination von Zytokinen fördert beispielsweise die Entstehung von Helferzellen, welche wiederum andere Komponenten des Immunsystems rekrutieren, um etwa einen Virus abzuwehren. Liegen diese Botenstoffe nicht in den richtigen Konzentrationen vor, kann das ein Hinweis auf eine Störung des Immunsystems oder eine Infektionserkrankung sein. Dabei ist aber immer nicht nur ein Signalgeber verantwortlich für den Gesamtzustand des Immunsystems, sondern eine Kombination von vielen verschiedenen.

Biologische Fängermoleküle mit synthetischen Beads verknüpfen
Forscher brauchen Methoden, mit denen sie möglichst viele Botenstoffe im Kontext untersuchen können [1]. Eine Möglichkeit bieten zytometrische Multiplex-Assays, mit denen bis zu 20 immunologische Parameter simultan aus Serum, Plasma- Proben oder Zellkulturüberständen identifiziert werden können. Herzstück dieser Assays sind mit Antikörpern beschichtete Kügelchen (Beads). Die Antikörper sind biologische Fängermoleküle, jedes spezifisch für ein nachzuweisendes Protein. Ein Antikörper eines bestimmten Typs wird mit einem Bead kombiniert (Abb. 1). Dabei hat dieses Bead eine fest definierte Größe und Fluoreszenzeigenschaft. Beads mit anderen Fluoreszenzeigenschaften und Größen werden mit anderen Antikörpern beschichtet; dadurch können sie dann später in einem Zytometer leichter voneinander getrennt werden. Da Größe und Fluoreszenzeigenschaften der Beads bekannt sind, kann dann jedes Bead einem nachzuweisenden Protein zugeordnet werden.

Mit einem zweiten Antikörper wird das im Zytometer detektierte Signal zusätzlich noch verstärkt. Es wird ein sogenanntes immunologisches Sandwich aufgebaut, bei dem das nachzuweisende Protein zwischen zwei Antikörpern eingefangen wird. Durch diesen zusätzlichen Trick wird der Assay besonders sensitiv. Es können also kleinste Proteinmengen nachgewiesen werden [2].

Der Vorteil des Multiplex-Verfahrens liegt auf der Hand: Es können viele Parameter gleichzeitig analysiert werden. Das spart Zeit und vor allem Probenvolumen, oft reichen nur wenigen Mikroliter. Mit üblichen einzelparametrischen Nachweisverfahren, wie etwa der ELISA-Methode, wird eine ähnliche Menge an Ausgangsmaterial gebraucht. Man kann aber immer nur einen Parameter bestimmen. Die Multiplex-Verfahren bieten hier den entscheidenden Vorteil, wenn nur wenig Ausgangsmaterial zur Verfügung steht. Außerdem muss die Probe nur einmal für die Analyse vorbereitet werden, wodurch wiederum viel Zeit bei der Handhabung der Probe gespart wird. Ein dritter wesentlicher Vorteil des Verfahrens ist, dass die Daten im Kontext betrachtet werden. Viele Daten im Zusammenhang können mehr Informationen liefern als die Einzelwerte. Dadurch bekommen solche Assays vor allem bei der Früherkennung von Krankheiten eine stärkere Aussagekraft [3].

Auf die Fragestellung zugeschnittene Software
Natürlich müssen die Daten genau analysiert werden. Je mehr Parameter gleichzeitig ausgewertet werden, desto schwieriger ist es, den Überblick zu behalten. Die verschiedenen Beads und Fluoreszenzkanäle müssen den Proteinen zugeordnet werden, es soll eine statistische Aussage getroffen werden und die Ergebnisse sollen möglichst reproduzierbar sein. Für diese Aufgabe gibt es mittlerweile speziell zugeschnittene Software, wie die M-Plex-Analyzer vom Fraunhofer FIT. Sie ist speziell für die Analyse von Bead-basierten Assays entwickelt worden.

Bei dieser Software kommt ein Wizard-Konzept zum Einsatz, das den Nutzer in logisch unterteilten Einzelschritten durch die Auswertung führt. Dabei werden immer nur die für die zu treffenden Entscheidungen relevanten Informationen präsentiert. Der Arbeitsablauf wird so auf das Wesentliche reduziert und die Auswertung deutlich vereinfacht. Im ersten Schritt des Wizards werden die gemessenen Beads in bis zu drei Populationen unterteilt. Die kombinierte Information aus Größe (Forward Scatter) und abgestrahltem Fluoreszenzlicht (Side Scatter) erlaubt dabei eine sehr genaue Unterscheidung. Diese erste Trennung ermöglicht, mehr Parameter in einer einzelnen Messung auszuwerten, da der gleiche Farbstoff so bis zu drei Analyten zugeordnet werden kann (Abb. 2).

Die Software erstellt für die Einteilung der Populationen automatisch einen Vorschlag. Ein Clustering-Algorithmus findet die optimale Unterteilung und schließt selbstständig Rauschsignale aus, die etwa durch Verschmutzungen entstehen. In der Regel muss der Nutzer den Vorschlag nur optisch kontrollieren. Ein großer Vorteil bei diesem Ansatz liegt in der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gegenüber einem manuellen Verfahren. Da Populationen aus mehreren Tausend Events bestehen, können bereits leichte Abweichungen bei der manuellen Auswahl einen Effekt für die spätere Auswertung haben, den der Nutzer in diesem Schritt nicht absehen kann. Der Computer hingegen arbeitet hier immer gleich.

Im nächsten Schritt werden die einzelnen Populationen anhand der Fluoreszenzemissionen der Beads weiter unterteilt und den Messparametern zugeordnet. Auch hier macht die Software auf Basis der Daten einen reproduzierbaren Vorschlag. Die Zuordnung zu den Analyten erfolgt ebenfalls automatisch, da die Software das Wissen über die verwendeten Beads bereits mitbringt. Das Ergebnis der Auswertung wird graphisch dargestellt und während der folgenden Kontrollen live angepasst. Hinweise auf Messfehler erfolgen über die Bewertung von Ausreißern, die der Nutzer ausschließen kann. Dieses direkte Feedback erleichtert die Entscheidung und kann Hinweise auf Auffälligkeiten geben.

Interaktives Feedback und Reporting
Aus den Ergebnissen der zweiten Unterteilung wird dann über Standardkurven auf die Konzentrationen der untersuchten Analyte zurückgeschlossen. Diese Standardkurven werden in der Regel für jede Messung neu anhand bekannter Konzentrationen erzeugt, um beispielsweise Effekte durch die Verwendung unterschiedlicher Zytometer auszuschließen. Die Software bietet verschiedene mathematische Modelle an, um zwischen den vermessenen Standardwerten zu interpolieren. Fehlmessungen und Ausreißer lassen sich an dieser Stelle ausschließen. Zur Verbesserung der statistischen Güte können mehrere Standardproben verwendet werden. Auch hier gibt die Software Feedback zur Güte der Auswertung. Die Genauigkeit der Standardkurven wird bei jeder Veränderung eingeblendet. Umgekehrt kann der Nutzer auch ein Gütekriterium vorgeben, das von der Kurve erfüllt werden muss, und erhält eine visuelle Warnung, wenn dies für einzelne Segmente nicht der Fall ist.

Die Ergebnisse werden abschließend in einen zusammenhängenden Report verwandelt. Alle relevanten Informationen und vom Nutzer getroffenen Entscheidungen sind hier hinterlegt. Ein weiterer Punkt, der die Nachvollziehbarkeit gewährleistet. Zusätzlich kann der Nutzer aus einer Vielzahl von Visualisierungen wählen und das Layout des Reports nach seinen Vorstellungen anpassen. Der Report ermöglicht es dem Experten, sich sehr schnell ein Bild von der Güte und den Ergebnissen der Auswertung zu machen.

Fazit
M-Plex-Analyzer bietet eine intuitive und leicht durchführbare Möglichkeit, um auch komplexe biologische Vorgänge zu untersuchen. Gerade die Kombination von erprobten biochemischen Kits mit einer auf den Assay zugeschnittenen Auswertungssoftware ist sicher ein zukunftsweisender Weg. Die Fragestellungen der Forscher werden immer komplexer und so ist auch in den letzten Jahren die Standard- Software immer komplexer geworden. Solche Workbench-Applikationen sind mittlerweile aber von vielen Usern kaum noch zu beherrschen. Auch in der Forschung wird der Trend in die Richtung gehen, dass immer häufiger spezialisierte Werkzeuge inklusive Software dem Forscher die Arbeit erleichtern.

Die Literatur ist bei den Autoren erhältlich.

Autor(en)

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Fraunhofer-Instituts für Angewandte Informationstechnik FIT
Schloß Birlinghoven
53757 Sankt Augustin
Telefon: +49 2241 14 2208
Telefax: +49 2241 142080

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