Biomedizin: Liposomen als therapeutische Nano-Taxis

Entwicklung von lipidbasierenden Wirkstoffträgersystemen

  • Abb. 1: Aufbau und Design von multifunktionellen Liposomen.Abb. 1: Aufbau und Design von multifunktionellen Liposomen.
  • Abb. 1: Aufbau und Design von multifunktionellen Liposomen.
  • Abb. 2: Größencharakterisierung von Liposomen mittels Nanopartikel Tracking Analyse (NTA). (A) Darstellung des technischen Grundprinzips der NTA. Ein Laser durchstrahlt eine Suspension mit Nanopartikeln und das Streulicht der einzelne Teilchen wird detektiert. (B) zeigt die vom Laser angestrahlten Liposomen. (C) Teilchengrößenverteilung und Konzentration. (D) Teilchengröße und relative Intensitätsverteilung und (E) als 3D-Plot dargestellt. Die mittlere Teilchengröße der Liposomen beträgt 146 nm mit einem Mittelwert von 133±47 nm. 90% der Teilchen sind kleiner als 201 nm. Die Konzentration beträgt ca. 10E+08 Teilchen /mL. Die Messung wurde mit dem Nanosight System LM10 von Malvern Instruments durchgeführt.

Biomedizin: Bei der Entwicklung moderner Therapieformen stehen der Schutz von Arzneistoffen vor unkontrolliertem und vorzeitigem Abbau im Körper sowie deren gezielte Freisetzung am Wirkort im Vordergrund. Neuartige auf Nanopartikel basierende Medikamente sollen zukünftig nur noch die Bereiche im menschlichen Körper ansteuern, die behandelt oder untersucht werden müssen.

Bei vielen therapeutischen Ansätzen oder diagnostischen Untersuchungen werden zum Erreichen der gewünschten Effekte hohe Mengen an chemischen Wirksubstanzen benötigt. Grund dafür ist die gleichmäßige Verteilung der verabreichten Stoffe im Körper, was jedoch dazu führt, dass der gesamte Organismus belastet wird und vermehrt Nebenwirkungen auftreten. Durch den gezielten Transport von Arzneistoffen oder Kontrastmitteln unter Verwendung „smarter" Nanopartikel ist nur mehr eine geringe Menge an Wirkstoff erforderlich, d. h. durch Nanopartikel können Wirkstoffdosen gesenkt und Nebenwirkungen reduziert werden. Darüber hinaus wird im Fall bildgebender Diagnoseverfahren ein besserer Kontrast im kranken Gewebe erwartet.

Liposomen für Therapie und Diagnostik
Seit mehr als vier Jahrzehnten wird der mögliche Einsatz von Liposomen, dies sind kugelförmige Phospholipid-Doppelschicht-Mikro / Nanoteilchen, als Wirkstoffträgersysteme (drug delivery systems) erforscht. Doch erst der wissenschaftliche Fortschritt der letzten Jahre ermöglichte den Durchbruch vor allem durch die Entwicklung komplexerer Trägersysteme [1,2]. Zum Beispiel wird die Oberfläche der Liposomen mit Polymermolekülen versehen, um eine längere Verweilzeit in der Zirkulation zu erlangen. Derart polymerumhüllte Liposomen vereinen meist mehrere Funktionen in einem einzigen Partikel, dessen Dimension 100 nm kaum überschreitet. Die liposomalen Nanoteilchen sind äußerst homogen und stabil und können mit neuartigen Wirkstoffen, wie Biopharmazeutika, sensiblen Proteinmolekülen, Nukleinsäuren oder kleinen organischen Substanzen beladen werden. Dabei fungieren sie als Schutzhüllen und Transporter.

Die Option zusätzlich noch Farbstoffe oder kontrastgebende Moleküle einzubauen, ermöglicht eine Sichtbarmachung der Partikel. Die „Farbgebung" erlaubt es, die Teilchen in der Zelle zu lokalisieren, bzw. durch deren Anreicherung im kranken Gewebe eine verbesserte oder frühere Diagnose mit bildgebenden Verfahren zu treffen. Die größte Herausforderung ist aber nach wie vor der gezielte Transport der Partikel in das erkrankte Gewebe. Eine Möglichkeit besteht darin, Zielfindungsmoleküle, dies können Antikörper, Proteine oder Peptide sein, an die Oberfläche der Teilchen zu koppeln, damit sie am Zielort spezifisch erkannt werden (Abb.1). Aufgrund ihrer speziellen Oberflächeneigenschaften und der geringen Größe, die ungefähr dem Fünfhundertstel einer durchschnittlichen Zelle entspricht, können Liposomen länger im Körper verweilen ohne abgebaut zu werden und haben somit genug Zeit sich im kranken Gewebe anzureichern. Von Vorteil ist auch, dass bei gewissen Krankheitsbildern, wie z.B. Krebs oder Arterienverkalkung, das Gewebe derart verändert ist, dass die Teilchen vermehrt aufgenommen und in die Zelle eingeschleust werden. Am Ziel angelangt, müssen die Partikel nun kontrolliert ihre Ladung über einen möglichst definierten Zeitraum freisetzen, um eine effiziente Wirkung des Arzneistoffes zu gewährleisten. Dies kann passiv oder auch aktiv durch Änderung der Temperatur oder des pH Wertes der Umgebung erreicht werden.

Design und Charakterisierung von therapeutischen Liposomen
Um das Konzept eines sogenannten „targeted drug delivery" mit Hilfe liposomaler Nanotransporter optimal umzusetzen, sind viele Parameter zu berücksichtigen. Dazu zählen die chemische Zusammensetzung, Partikelgröße, Oberflächenladung sowie die Morphologie der Teilchen und deren Oberflächen. Wichtig ist dabei, dass die biophysikalischen Eigenschaften der Liposomen speziell in Hinblick auf die Darreichungsform (z. B. intravenös als Lösung, inhalativ als Aerosol oder oral als Tablette) angepasst werden. Besondere Rücksicht muss auf die chemischen Charakteristika des zu transportierenden Wirkstoffes genommen werden; Proteine verhalten sich anders als hydrophobe organische Moleküle.

Die Synthese der Liposomen erfolgt nach dem „bottom up" Prinzip aus der organischen Phase durch Selbstassemblierung der Lipidmoleküle. Die Teilcheneigenschaften und die Partikelgröße können durch die molekulare Zusammensetzung und das Herstellungsverfahren mit nachfolgender Größenextrusion gezielt beeinflusst werden. Eine homogene Verteilung hinsichtlich der Partikelgrößen ist besonders für eine reproduzierbare Produktion und Beladungseffizienz mit Wirkstoffen von ausschlaggebender Bedeutung. Zu den gängigsten Methoden zur Größenbestimmung von pharmazeutischen Nanotransportern zählt die Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS). Mit dieser auf dynamischer Lichtstreuung basierenden Methode können schnell und zuverlässig Aussagen über die mittlere Teilchengröße und die Polydispersität der Präparation getroffen werden. Eine alternative neuere Technik beruht auf der sogenannten Nanopartikel Tracking Analyse (NTA), die von der Firma Nanosight entwickelt wurde. Hierbei können die einzelnen Nanopartikel, in diesem Fall Liposomen, indirekt sichtbar gemacht werden. Bei der NTA wird ein Laserstrahl durch die Probenkammer geleitet und das Streulicht jener Teilchen, die sich in der Bahn des Strahls befinden detektiert und durch ein Mikroskop aufgefangen (Abb. 2). Die molekulare Bewegung der einzelnen Teilchen wird mit einer Videokamera aufgezeichnet. Mithilfe der Stokes-Einstein Gleichung ist es nun möglich den hydrodynamischen Durchmesser jeden Teilchens zu berechnen. Durch NTA können exakte Aussagen über die Größe (im Bereich zwischen ca. 10 bis 2000 nm), die Größenverteilung und die Konzentration der Teilchen getroffen werden. Gleichzeitig ist eine visuelle Validierung der Partikelpopulation in Echtzeit möglich. Die beiden Methoden, PCS und NTA, ergänzen sich und ermöglichen dem Experimentator eine globalere Aussage über die Teilchengrößenverteilung zu treffen. Mit diversen elektronenmikroskopischen Methoden ist es möglich noch Informationen über die Morphologie der Teilchen zu erhalten. Nur derart exakt charakterisierte und definierte Teilchen können für eine therapeutische oder diagnostische Anwendung in Betracht gezogen werden.

Die chemische Kopplung von Zielfindungsmolekülen bzw. die Komplexierung von signalgebenden Molekülen an die Oberfläche erfolgt meist in einem nachfolgenden Schritt. Zu den gängigsten Methoden um Moleküle an funktionalisierte Lipide zu binden zählen die Maleimid-Kopplung an Thiole und die Succinimidylester-Kopplung an Aminogruppen. Nach der Kopplungsreaktion werden ungebundene Substanzen abgetrennt und das Produkt mittels Säulenchromatographie oder Dialyse aufgereinigt. Nach entsprechender Quantifizierung werden die Liposomen erneut einer physikalisch-chemischen Charakterisierung unterzogen. Dabei werden Größe, Größenverteilung und Wirkstoffbeladung als maßgebliche Kriterien für die Qualität und Stabilität der Präparation herangezogen. Die im Labormaßstab hergestellten multifunktionellen Liposomen stehen danach für die jeweilige Anwendung zur Verfügung.

Theranostik und personalisierte Medizin
Die aktuelle medizinische Forschung verlangt nach individuellen Lösungen und Ansätzen unter Verwendung neuer innovativer Materialien. Vor allem Liposomen, die biologisch abbaubar und für den menschlichen Organismus unbedenklich sind, bieten viele Kombinationsmöglichkeiten durch ein flexibles und einfach handhabbares Baukastenprinzip. Dank ihrer Multifunktionalität können die selben Teilchen sowohl als Therapeutika als auch für diagnostische Verfahren herangezogen werden. Unter Zuhilfenahme solcher Teilchen könnte der Verlauf der Therapie diagnostisch mitverfolgt und die Behandlung spezifisch auf die Bedürfnisse des Patienten abgestimmt werden.

Ausblick
Trotz vieler Anfangsschwierigkeiten und regulatorischen Hürden haben die ersten auf Nanopartikel basierenden Medikamente, speziell für die Krebstherapie, den Markt erreicht und viele befinden sich bereits in der Pipeline. Entsprechend hat sich mit der Zeit eine Liposomen-Nanopartikelplattform herauskristallisiert, die den Weg vom Konzept bis zur klinischen Anwendung erfolgreich durchlaufen hat. Für die nächsten Jahre ist ein vermehrter Einsatz und ein breiteres Spektrum von funktionalisierten Liposomen als Nano-Therapeutika am Markt zu erwarten.

Referenzen
[1] Allen T.M. and Cullis P.R. : Adv Drug Deliv Rev, 65 36-48 (2013)
[2] Sawant R.R. and Torchilin V.P. : AAPS J., 14 303-315 (2012)

Kontakt
Prof. Ruth Prassl
Institut für Biophysik
Medizinische Universität Graz

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