Massenspektrometrische Technologien in der klinischen Forschung

Schwerpunkt auf der klinisch-chemischen Diagnostik

  • Abb. 1: Fragment-Ionenspektrum eines tryptisch verdauten Peptids mit einer Molekularmasse von 1852 Da. Die MALDI-PSD (MALDI-Post-Source-Decay) Fragmente zeigen (in einer Abfolge von b- und y-Ionen Signale) die aminoterminale Sequenz des bFGF (basischen Wachstumsfaktors) mit einem zusätzlichen Alanin am äußeren Ende.Abb. 1: Fragment-Ionenspektrum eines tryptisch verdauten Peptids mit einer Molekularmasse von 1852 Da. Die MALDI-PSD (MALDI-Post-Source-Decay) Fragmente zeigen (in einer Abfolge von b- und y-Ionen Signale) die aminoterminale Sequenz des bFGF (basischen Wachstumsfaktors) mit einem zusätzlichen Alanin am äußeren Ende.
  • Abb. 1: Fragment-Ionenspektrum eines tryptisch verdauten Peptids mit einer Molekularmasse von 1852 Da. Die MALDI-PSD (MALDI-Post-Source-Decay) Fragmente zeigen (in einer Abfolge von b- und y-Ionen Signale) die aminoterminale Sequenz des bFGF (basischen Wachstumsfaktors) mit einem zusätzlichen Alanin am äußeren Ende.
  • Abb. 2: Aufbau eines Massenspektrometers bzw. eines Tandem-Massenspektrometers.
  • Abb. 3: MRM-Chromatogramme einer Serumprobe eines Patienten der MPA als Medikament einnimmt. Die Probe wurde mit den internen Standards PPA (N-Phthaloyl-L-phenylalanin) und PPG (Phenolphthalein-β-glucuronsäure) versetzt. (A) MRM-Übergang des Ammoniumaddukts von MPAG, m/z = 514,2 > 207,1; (B) MRM-Übergang des internen Standards für MPAG welches das protonierte Addukt von PPG ist, m/z = 495,1 > 319,1; (C) MRM-Übergang des Ammoniumaddukts von MPA, m/z = 338,1 > 207,1; (D) MRM-Übergang des protonierten Addukts von MPA, m/z = 321,0 > 207,1; (E) MRM-Übergang des internen Standards für MPA welches das protonierte Addukt von PPA ist, m/z = 296,1 > 250,1.

Massenspektrometrische Untersuchungen haben in den letzten Jahren sukzessiv Einzug in nahezu alle Bereiche der klinischen Forschung und Entwicklung gehalten, dank den neuen Ionisierungstechniken wie MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization), APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) und ESI (Elektrospray Ionisation).

In der Proteomforschung und der klinischen Mikrobiologie wird die MALDI-MS-Technik meist zur qualitativen Charakterisierung von komplexen Substanzgemischen aus organischem Gewebe oder aus Bakterien eingesetzt. In der klinischen Chemie dienen dagegen vorwiegend ESI- und APCI-MS-Techniken für immer empfindlichere quantitative Messungen von klinisch-chemischen Analyten. Hierbei erfolgt, i. Allg. nach Auftrennung komplexer Probenmatrices durch verschiedenste chromatographische Trenntechniken, die quantitative Analyse in einem nachgeschalteten Tandem-Massenspektrometer (TMS).

Proteomforschung
Die massenspektrometrische Analyse von Proteinen und Peptiden ist eine zentrale Untersuchung in der Proteomforschung. Dank der ständigen Verbesserung der Massenspektrometer wird die massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen und Peptiden heute mittlerweile routinemäßig durchgeführt. Bei der MALDI-Technik werden durch einen Laserbeschuss die in einer Matrix eingebetteten Analyte (i. Allg. Proteine oder Peptide) ionisiert und in die Gasphase überführt. Anschließend werden die erzeugten Ionen in einem elektrischen Feld beschleunigt und in einem Massenanalysator gemessen. In der Vergangenheit lag die Hauptanwendung dieser Technik in der exakten Massenbestimmung und der Sequenzierung von Proteinen und Peptiden [1] (Abb. 1). Wobei alternierende CID- (Collision Induced Dissociation) und ETD- (Electron Transfer Dissociation) Messungen nicht nur die genauen Sequenzinformationen liefern sondern darüber hinaus auch posttranslationale Modifikationen detektieren.

Heute werden MeCAT-Metallkodierung (Metal Coded Tagging Technology) oder auf dem Einsatz stabiler Isotope basierende quantitative Verfahren wie ITRAC (isotope Tags for Relative and Absolute Quantitation), SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acids), TMT (Tandem Mass Tags) oder ICAT (Isotope Coded Affinity Tag) eingesetzt bzw. entwickelt, um den Proteinbestand ganzer Zellen, sowie die Verfolgung dynamischer Prozesse auf der Proteinebene, aufzuklären [2]. Die Analyse der durch diese Verfahren in vitro oder in vivo markierten Proteinen ermöglichen heute moderne ultrasensitive Massenspektrometer.

Biomarker
In der klinisch-chemischen Forschung werden u. a. MS-Spektren von biologischen Proben für die Entwicklung spezieller diagnostischer Tests genutzt. Hierzu vergleicht man z. B. MS-Spektren einer Serumprobe von einem Kranken und einem Gesunden, um krankheitsspezifische Massenpeaks zu detektieren. Die Suche nach spezifischen Biomarkern für Erkrankungen wie Diabetes, kardiovaskuläre Erkrankungen oder Krebs steht hierbei oft im Mittelpunkt dieser Forschung [3, 4]. Eine weitere in der Entwicklung befindliche Technologie ist die Imaging Massenspektrometrie, mit der man versucht, molekulare Prozesse in lebenden Organismen dreidimensional darzustellen ohne die Struktur des Systems zu zerstören. Beim MALDI-Imaging werden z. B. Proteomdaten mit histologischen Informationen verknüpft, um beispielsweise Tumorzellen zu charakterisieren. Die Kombination der Daten ermöglicht die direkte Analyse der Tumorprobe, wobei die morphologischen Informationen des Gewebes erhalten bleiben.

Massenspektrometrie in der Mikrobiologie
Die Identifikation von Keimen mittels MALDI-TOF-MS hat in den letzten Jahren die mikrobiologische Diagnostik geradezu revolutioniert. Nach dem Auftragen einer kleinen, mit einer geeigneten Matrix versetzten Bakterienkolonie auf eine MALDI-Probenplatte und der Generierung von MS-Spektren, erfolgt die molekulare Speziesdifferenzierung. Diese geschieht durch die Analyse des Proteinprofils aus mehrheitlich ribosomalen Proteinen. Die Spektren werden hierfür mit einer im System intergierten umfangreichen Referenzdatenbank an human-medizinisch relevanten Bakterien und Pilzen abgeglichen [5]. Im Vergleich zu klassischen Differenzierungsverfahren bietet dieses Verfahren sehr kurze Analysezeiten sowie eine hohe Automatisierbarkeit, Empfindlichkeit und Präzision [6].

Massenspektrometrische Tests in der klinisch-chemischen Diagnostik
In der klinisch-chemischen Diagnostik hat sich die LC-MS/MS (Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie) inzwischen als leistungsfähige Technologie zur quantitativen Messung von Analyten mit niedriger Molekularmasse bewährt. Typische Anwendungsfelder sind hierbei das TDM (Therapeutische Drug Monitoring), das Neonatalscreening und die Forensik. Die LC-MS/MS spielt aber auch eine immer bedeutendere Rolle bei der Entwicklung von Referenzmethoden, in der endokrinologischen Labordiagnostik sowie bei speziellen Untersuchungen wie z. B. bei der Messung von Enzymaktivitäten [7, 8]. Moderne Massenspektrometer besitzen erweiternde Funktionen wie Scanwave, PICS und Radar. Die Scanwave Funktion ist eine innovative Technologie zur schnellen Aufnahme von hochwertigen Produktspektren. PICS (Product Ion Conformation Scan) kann die Scanwave Funktion mit der MRM (Multiple Reaction Monitoring) Funktion kombinieren, womit die eindeutige Identifizierung einer Substanz ermöglicht wird. Radar bezeichnet einen Akquisitions Modus, der die Aufnahme hochspezifischer quantitativer Daten für Zielkomponenten (MRM) und zeitgleich dazu die Visualisierung aller anderen Komponenten der Matrix erlaubt.

Mit den immer empfindlicheren Massenspektrometern ist es mittlerweile auch möglich körpereigene Substanzen, die nur in sehr geringen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten vorkommen, wie z. B. Hormone, sicher, zuverlässig und hochspezifisch zu quantifizieren. Mit modernen Systemen wird heutzutage nach der chromatographischen Auftrennung mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) oder UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatographie) die eigentliche Messung der Analyten im nachgeschalteten ESI-TMS im MRM-Modus durchgeführt. Hierbei wird im ersten Massenanalysator des TMS das Molekül-Ion des zu messenden Analyten (Mutter-Ion) mit Hilfe des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses (m / z) selektiert, dies wird wiederum in der nachgeschalteten Kollisionszelle fragmentiert und die dadurch entstandenen spezifischen Tochter-Ionen im zweiten Massenanalysator analysiert (Abb. 2). Diese Übergänge von Mutter-Ion zu Tochter-Ion(en) sind sehr spezifisch, da die Fragmentierung eine Stoffeigenschaft ist, die nach einem eindeutigen Muster erfolgt. Meist verwendet man den empfindlichsten Übergang zur Quantifizierung des Analyten (Quantifier) und einen weiteren Übergang zur Bestätigung (Qualifier) der Messung [9]. Mit Ionenfallen-Massenspektrometern bei denen die Fragment-Ionen weiter fragmentiert werden -MS/MS/MS bzw. MSn - können noch höhere Selektivitäten erreicht werden.

Bei der Entwicklung von LC-MS/MS-Tests sind störende Einflussfaktoren wie Matrixeffekte oder Fragmentierungsprozesse während der Ionisierung zu berücksichtigen. Bei Matrixeffekten werden durch die Anwesenheit von coeluierenden, nicht flüchtigen Substanzen (Matrix) Schwankungen in der Ionisierungseffizienz hervorgerufen. Diese können zur Ionensuppression oder -verstärkung und damit, ohne einen entsprechenden Ausgleich, zu falschen Messergebnissen führen. Um die störenden Einflüsse der Matrix zu eliminieren, wird im Idealfall ein interner Standard mitgeführt, der die gleichen Stoffeigenschaften wie der zu messende Analyt besitzt (ein dem Analyt entsprechendes Isotop), da dieser zur gleichen Zeit wie der Analyt eluiert und auf den damit auch die gleiche Ionensuppression oder -verstärkung wirkt. Durch diese interne Kontrolle kann der durch die Matrix verursachte Effekt bei der Messung berücksichtigt bzw. eliminiert werden. Mittlerweile stehen immer mehr nichtradioaktive Isotope als interne Standards zur Verfügung [9 - 11].

Eine weitere Einflussgröße, die insbesondere bei Elektrospray-Ionisierung zu falschen Messergebnissen führen kann, ist die Fragmentierung von Molekülen (In-Source Fragmentation) während des Ionisierungsprozesses. Entsteht bei dieser Ionisierung der zu messende Analyt aus einem komplexeren Molekül als Fragment, so kann das zu falschen Messwerten führen. Dies kann insbesondere bei TDM zu einem Problem werden, da viele Medikamente glucuronidiert, hydroxyliert, oxidiert oder auf eine Art und Weise im menschlichen Körper metabolisiert werden. Die durch die Metabolisierung größeren Moleküle können dann u. U. in der Ionenquelle wieder zu dem ursprünglichen Medikament fragmentieren. Die Abbildung 3 zeigt dazu ein Beispiel anhand einer Serumprobe eines herztransplantierten Patienten, der das Medikament MPA (Mykophenolsäure) zur Immunsuppression einnimmt [12]. Das im menschlichen Körper zu MPAG (Mykophenolsäureglucuronid) metabolisierte Medikament MPA zerfällt beim Ionisieren in der Ionenquelle wieder zu MPA (Abb. 3D: In-Source Fragmentation Produkt von MPAG). Dieses in der Ionenquelle gebildete MPA besitzt die gleiche Retentionszeit wie das MPAG bzw. wie dessen Ammoniumaddukt (Abb. 3D und 3A) aber eine andere Retentionszeit als das MPA in der Serumprobe, das hier als Ammoniumaddukt gemessen wird (Abb. 3C). Das in der Ionenquelle gebildete MPA muss, um keine falsch zu hohen Werte zu erhalten, chromatographisch eindeutig von dem in der Probe vorhandenen MPA getrennt werden (Abb. 3D).

Zusammenfassung
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Massenspektrometrie in den letzten Jahren einen rasanten Aufstieg in allen Bereichen der klinischen Forschung, Entwicklung und Diagnostik erlebt hat. Keine andere Technologie ist in diesen Bereichen vielseitiger einsetzbar oder zeigt ein höheres Entwicklungspotential als die spezifische und/oder präzise Massenbestimmung von Molekülen.

Literatur
[1] Kuhn J. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 333, 156-166 (2005)
[2] Domon B. and Aebersold R.: Nat. Biotechnol. 28, 710-721 (2010)
[3] Bakry R. et al.: Anal. Chim. Acta 690, 26-34 (2011)
[4] Di Girolamo F. et al.: Biomark. Med. 6, 759-773 (2012)
[5] Schubert S. und Wieser A.: BIOspektrum 16;760-762 (2009)
[6] Claydon M.A. et al.: Nat. Biotechnol. 14, 1584-1586 (1996)
[7] Kuhn J. et al.: Clin. Chem. 52; 2243-2249 (2006)
[8] Kuhn J. et al.: Clin. Biochem. 42;521-527 (2009)
[9] Kuhn J. and Knabbe C.: Talanta 110, 71-80 (2013)
[10] Kuhn J. et al.: J. Pharma. Biomed. Anal. 51, 210-216 (2010)
[11] Kuhn J. et al.: J. Pharma. Biomed. Anal. 67-68, 137-143 (2012)
[12] Kuhn J. et al.: Talanta 80, 1894-1898 (2010)

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