Screening von Krebstherapeutika

Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung mit 3D-Sphäroiden

  • Abb. 1: (Oben) Projektion mit dem best-Fokus Algorhytmus von 15 Bildern eines HCT116-Spheroids, das mit Widefieldoptik aufgenommen wurde. Die Software-Segmentierung hat 817 Zellkerne gezählt. Wegen Verzerrung durch unfokussierte Fluoreszenz an den Rändern des Spheroids und wegen schlecht abgebildeter dunkler Zellen im Zentrum wurde eine bestimmte Anzahl von Zellkernen nicht erfasst. (Unten) Best-Focus-Projektion von 15 Bildern eines HCT116-Spheroids, die mit konfokaler Optik aufgenommen wurden. Eine genauere Anzahl von 1078 Kernen wurde gezählt.Abb. 1: (Oben) Projektion mit dem best-Fokus Algorhytmus von 15 Bildern eines HCT116-Spheroids, das mit Widefieldoptik aufgenommen wurde. Die Software-Segmentierung hat 817 Zellkerne gezählt. Wegen Verzerrung durch unfokussierte Fluoreszenz an den Rändern des Spheroids und wegen schlecht abgebildeter dunkler Zellen im Zentrum wurde eine bestimmte Anzahl von Zellkernen nicht erfasst. (Unten) Best-Focus-Projektion von 15 Bildern eines HCT116-Spheroids, die mit konfokaler Optik aufgenommen wurden. Eine genauere Anzahl von 1078 Kernen wurde gezählt.
  • Abb. 1: (Oben) Projektion mit dem best-Fokus Algorhytmus von 15 Bildern eines HCT116-Spheroids, das mit Widefieldoptik aufgenommen wurde. Die Software-Segmentierung hat 817 Zellkerne gezählt. Wegen Verzerrung durch unfokussierte Fluoreszenz an den Rändern des Spheroids und wegen schlecht abgebildeter dunkler Zellen im Zentrum wurde eine bestimmte Anzahl von Zellkernen nicht erfasst. (Unten) Best-Focus-Projektion von 15 Bildern eines HCT116-Spheroids, die mit konfokaler Optik aufgenommen wurden. Eine genauere Anzahl von 1078 Kernen wurde gezählt.
  • Abb. 2: (Oben) Montage mit Miniaturansichten von HCT116-Spheroiden auf einer 96-Well-Platte, die mit Substanzen behandelt und mit einem 10-fach-Plan-Fluor-Objektiv aufgenommen wurden. Mit Hoechst gefärbte Zellkerne (blau) sind mit Apoptosemarker CellEvent Caspase 3/7 (grün) überlagert. Die unbehandelten Kontrollen sind in Spalte 4 aufgeführt. Eine Caspase 3/7-Reaktion zeigt sich in den Spalten 5–7, wo 1 µM Paclitaxel in Reihe A in einer Konzentrationsreihe auf 1:3 verdünnt wurde (jeweils 3 Replikate). (Links) Elf z-Ebenen wurden mit Maximum Projection in einem 2D-Bild kombiniert und mit einem einfachen anwendungsspezifischen Modul analysiert. Die Rohbilder zeigen mit den entsprechenden Segmentierungsmasken einen niedrigen und hohen Grad von Apoptose (royalblau = Kerne, rosa = apoptotische Zellen). (Rechts) Durch Normalisieren des Apoptosevorkommens im Vergleich zu unbehandelten Spheroiden und Darstellung in einem Diagramm wird erkennbar, dass zur Induzierung von Apoptose mit Paclitaxel (grüne Linie) eine viel niedrigere Konzentration erforderlich ist als mit Mitomycin C oder Etoposid.
  • Abb. 3: Toxische Wirkung von Antimycin A auf Mitochondrien. (Oben) Überlagerung der Färbemittel Hoechst (blau) und MitoTracker (orange) bei Spheroiden, die mit Antimycin A in steigenden Konzentrationen von 1, 22, 67 und 200 nM behandelt wurden. (Unten) Darstellung von durchschnittlichen Intensitätswerten von Mitochondrien, die im Spheroid identifiziert wurden. Dies illustriert die Wirkung der Substanz.

Beim Screening nach potenziellen Krebstherapeutika besteht ein wachsendes Interesse am Einsatz von 3D-Spheroiden, da man glaubt, dass sie das Tumorverhalten besser imitieren als 2D-Zellkulturen. Wir erörtern hier einige der Herausforderungen bei der Entwicklung robuster Spheroid-Assays, mit denen eine schnelle Bildgebung und Analyse von 3D-Spheroiden auf Mikrotiterplatten erfolgen kann.

Einführung
In den letzten Jahren gab es große Fortschritte bei der Entwicklung von in-vitro-Aggregaten von Tumorzellen, die als Modelle für in-vivo-Gewebestrukturen dienen. Wenn sie in einer Low-Attachment-Rundboden-Mikrotiterplatte ausgesät werden, bilden diese Aggregate ein diskretes Spheroid. Spheroide sollen das Tumorverhalten besser imitieren als herkömmliche zweidimensionale (2D-)Zellkulturen, weil sie ähnlich wie Tumoren oberflächenexponierte und tief eingebettete Zellen, proliferierende und nicht-proliferierende Zellen und ein hypoxisches Zentrum mit einer gut oxygenierten äußeren Zellschicht aufweisen. Solche 3D-Spheroid-Modelle werden erfolgreich beim Screening zur Identifizierung potenzieller Krebstherapien eingesetzt. Wir erörtern hier einige der Herausforderungen bei der Entwicklung robuster Spheroid-Assays und wie sie adressiert werden können.

Spheroidbildung und -behandlung
Mit dem folgenden Verfahren haben wir Spheroide aus den Krebszelllinien HCT116, DU145 und HepG2 gebildet. Die Zellen wurden bei 37°C unter 5 % CO2 in Kulturflaschen kultiviert, anschließend abgetrennt und auf 96- oder 384-Well-Platten mit schwarzem Rand, klarem Boden und U-förmigen Wells (Corning 4520 bzw. 3830) in entsprechenden Medien angesetzt, die mit fötalem Kälberserum (FBS) ergänzt wurden. Die Zelldichte betrug 1000 bis 1500 Zellen/Well. Innerhalb von 24 Stunden bildete sich auf dem Boden jedes Wells ein einzelnes Spheroid, das 2–4 Tage bei 37°C und 5% CO2 wachsen konnte, bis es für Experimente eingesetzt wurde. Die Spheroide können zwar noch länger kultiviert werden, aber die zunehmende Größe kann die Durchfärbung und das Abbilden der im Zentrum gelegenen Zellen behindern.

Wir beschreiben hier Assays, mit denen die Wirkung der Antikrebssubstanzen Etoposid, Paclitaxel und Mitomycin C ermittelt wird. Zur Behandlung der Spheroide wurden die Substanzen in 10-facher Konzentration in die Wells zugesetzt. Die anschließende Inkubation dauerte 1–4 Tage, je nach Mechanismus, der untersucht werden sollte. Zur Untersuchung von Apoptose wurden kürzere Einwirkzeiten, für die multiparametrische Untersuchung der Zytotoxizität längere Einwirkzeiten berücksichtigt. Bei einer Inkubation von mehr als 2 Tagen wurde die Substanz alle 2 Tage in 1-facher Konzentration erneuert.

Färbung und Abbildung von Spheroiden
Die hier gezeigten Beispiele stammen aus der Entwicklung eines HCT116-Spheroid-Assays zur Untersuchung von morphologischen Veränderungen an Spheroiden sowie dem Auftreten von apoptotischen Zellen im Well. Nach Abschluss der Behandlung mit den Substanzen wurden die Färbemittel in einem einzigen Cocktail mit 4- bis 6-facher Konzentration kombiniert und die Medien in den Wells direkt damit versetzt. Hierbei wurden Färbemittel eingesetzt, die kein Waschen erfordern, um eine Störung der Spheroide zu vermeiden.

Die Sphäroide wurden mit dem ImageXpress Micro High-Content-Screening-System (Molecular Devices) bei 10- oder 20-facher Vergrößerung sichtbar gemacht. Um die Reaktionen der Zellen in der gesamten 3D-Struktur zu analysieren, wurden Bilder aus verschiedenen Tiefenschichten des Spheroid-Körpers zu einem „Stapel“ zusammengefasst. Der Bilderstapel wurde dann mithilfe eines mathematischen Algorithmus zu einem einzigen 2D-Projektionsbild kombiniert („kollabiert“). In diesem Fall wurde das kollabierte Bild mit dem Maximum-Projection-Algorithmus der Software generiert. Zur Erzeugung der Projektion werden hierbei die Pixel mit der größten Intensität in dem Stapel beibehalten.

Die konfokale Optik bietet die Möglichkeit, einen schmaleren optischen Schnitt des Sphäroids abzubilden als die Widefieldoptik. Dadurch wird das Hintergrundsignal verringert, das durch fluoreszierende Objekte oberhalb und unterhalb der Ebene erzeugt wird. In der Regel wird auch eine bessere Auflösung der feinen Details auf subzellulärer Ebene oder zwischen den Zellen erzielt, die wie in einer 3D-Struktur geclustert oder gestapelt übereinanderliegen. Mit einem konfokalen Bild ist häufig eine genauere Segmentierung möglich. In wiederholten Experimenten mit Sphäroiden wurden bei der Segmentierung von Zellkernen in Widefieldbildern ca. 20 % weniger Zellkerne gezählt als in konfokalen Bildern (Abb. 1).

Screening von Antikrebsmitteln mit einem Apoptose-Assay
Eine Klasse von Antikrebsmitteln zielt auf den extrinsischen Signalweg der Apoptose, um den Zelltod auszulösen. Um einen Assay für die Apoptose zu demonstrieren, wurden HCT116-Spheroide, die 3 Tage lang in 96-Well-Platten kultiviert worden waren, 24–48 Stunden lang mit einer Verdünnungsreihe von 4 verschiedenen Antikrebssubstanzen behandelt. Nach Abschluss der Behandlung wurde die Apoptose mit den Reagenzien CellEvent Caspase und MitoTracker Orange von Life Technologies detektiert. Die Medien in den Wells wurden dann mit einem 4-fach-Cocktail der kombinierten Färbemittel, darunter Hoechst Zellkernfärbemittel, versetzt. Hierbei wurden Färbemittel eingesetzt, die kein Waschen erfordern, um eine Störung der Sphäroide zu vermeiden (Abb. 2).

Multiplex-Assay des mitochondrialen Membranpotentials im Screen
In dem o. g. Apoptose-Screen kann das mitochondriale Membranpotential auch durch Zugabe von MitoTracker Orange zum Färbemittel-Cocktail bestimmt werden. Alternativ können Substanzen, die das Tumorwachstum durch Einwirkung auf den Mitochondrien-Stoffwechsel hemmen, getrennt untersucht werden. Veranschaulicht wird dies durch einen Assay mit Antimycin A, einem wirksamen Disruptor des mitochondrialen Membranpotentials. Nach 4 Stunden Behandlung war der Zustand der Mitochondrien anhand der Intensität von MitoTracker Orange in den Sphäroid-Zellen nachweisbar. Entweder war MitoTracker nicht vollständig in das Zentrum der großen Sphäroide vorgedrungen, oder die Zellen im Zentrum weisen keine gesunden Mitochondrien auf, worauf das allgemein dunklere Erscheinungsbild im Inneren auf der Mitochondrien-Wellenlänge der Bilder hinweist (Abb. 3).

Schnell-Screening von 3D-Sphäroiden auf Mikrotiterplatten
Zur Vereinfachung von aussagekräftigen Prüfverfahren von Wirkstoffkandidaten für die Chemotherapie sind zwei Faktoren von großer Bedeutung: einerseits die Fähigkeit von In-vivo-3D-Kultursystemen, Spheroide menschlicher Krebszellen von einheitlicher Größe zu produzieren, und andererseits die Möglichkeit, die Reaktionen der Spheroide auf die Behandlung mit automatisierten Hochdurchsatz-High-Content-Bildgebungsverfahren zu untersuchen. Das ImageXpress Micro High Content Confocal Imaging System und die MetaXpress Image Analysis Software ermöglichen eine schnelle Bildgebung und Analyse von 3D-Sphäroiden auf Mikrotiterplatten zum nachweis von induzierter Apoptose und mitochondrialer Toxizität von Krebsmedikamenten.

Literatur
Oksana Sirenko, Trisha Mitlo, Jayne Hesley, Steve Luke, Windsor Owens, Evan F. Cromwell: High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay and Drug Development Technologies, 13(7), 402-14

Zugehörigkeit
1Research Scientist, Molecular Devices,
Sunnyvale, CA, USA

Kontakt
Malte Weber
Account Manager, Germany
Molecular Devices GmbH
malte.weber@moldev.com
www.moleculardevices.com
 

Autor(en)

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