Von der Stammzelle zum Neuron

"Live" Beobachtung des Stammzellschicksals im Hirn

  • Abb. 1: Genregulatoren zeigen den Entwicklungsstand der Zellen an. Der DCX-Promoter ist ein Marker für frühe Neurone, der Syn-Promoter ein Marker für reife Neurone, die Synapsen mit anderen Zellen bilden.Abb. 1: Genregulatoren zeigen den Entwicklungsstand der Zellen an. Der DCX-Promoter ist ein Marker für frühe Neurone, der Syn-Promoter ein Marker für reife Neurone, die Synapsen mit anderen Zellen bilden.
  • Abb. 1: Genregulatoren zeigen den Entwicklungsstand der Zellen an. Der DCX-Promoter ist ein Marker für frühe Neurone, der Syn-Promoter ein Marker für reife Neurone, die Synapsen mit anderen Zellen bilden.
  • Abb. 2: Quantitative in vivo Darstellung der neuronalen Reifung von implantierten Stammzellen. (A und B) Repräsentative Bilder von implantierten Stammzellen mit Bildgebungsreportern unter dem (A) DCX-Promoter und (B) als Kontrolle unter einem aktiven Promoter. (C) Signifikanter Anstieg des Biolumineszenz-Signals bei den Tieren, die die Bildgebungsreporter unter dem DCX-Promoter bildeten. Kein signifikanter Anstieg konnte bei der Kontrolle festgestellt werden.
  • Abb. 3: Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung von implantierten Stammzellen. (A) Implantierte differenzierte Stammzellen zeigen Aktionspotentiale. Das Aktionspotential wurde mittels TTX aufgehoben. (B) Biocytin-Markierung der implantierten Stammzellen. (C) In undifferenzierten Stammzellen konnte kein Aktionspotential gemessen werden.

Implantierte Stammzellen können in vivo zu funktionsfähigen Nervenzellen differenzieren. Bislang war es jedoch nicht möglich, diesen dynamischen Prozess 'live' zu beobachten. Ein neues Verfahren ermöglicht es nun, diesen Vorgang im lebenden Gehirn zu untersuchen und eröffnet damit neue Perspektiven, Stammzellen als Therapieansatz in neurodegenerativen Erkrankungen zu verwenden.

Bei neurodegenerativen oder anderen Erkrankungen des Hirns werden Nervenzellen geschädigt. So sterben beim Schlaganfall zum Beispiel gleich ganze Hirnregionen ab. Den Patienten bleiben nach Schlaganfall nur wenige Stunden (3 - 4.5 Stunden) [1,2], um eine erfolgreiche Therapie mittels tPA (tissue Plasminogen Activator) zu beginnen [3]. Ist diese Zeitspanne überschritten, gibt es zurzeit keine effiziente Behandlung und für den Patienten bedeutet dies gravierende Behinderungen und Einschränkung seiner Lebensqualität. Die Hoffnung für Patienten richtet sich auf implantierte Stammzellen, um die verloren gegangenen Funktionen im Gehirn wieder herzustellen [4]. Doch wichtige Fragen sind noch unbeantwortet: Wo müssen die Stammzellen implantiert werden, damit sie möglichst gut überleben, welche Bedingungen brauchen sie, um sich dann bevorzugt zu Nervenzellen zu entwickeln und den Heilungsprozess optimal zu fördern?

Stammzellen melden ihren Entwicklungszustand über "Bildgebungs-Reporter"

Konventionelle Methoden untersuchen das Überleben und die Entwicklung von implantierten Stammzellen am Gewebeschnitt mit einem Mikroskop. Doch dies ist nur eine Momentaufnahme des Endpunktes eines dynamischen Prozesses [5,6]. Unserer Arbeitsgruppe am Kölner Max-Planck-Institut für Stoffwechselforschung ist es jetzt gelungen, die Stammzellen so zu verändern, dass sie nur in bestimmten Phasen ihrer Entwicklung optische Marker, so genannte Bildgebungsreporter, bilden. Diese spezifischen Phasen der Stammzelldifferenzierung werden selektiert, indem die Expression der Bildgebungsreporter in der Zelle durch Promotoren kontrolliert werden. Wir haben dafür zwei unterschiedliche Bildgebungsreporter eingesetzt, welche von den Zellen in bestimmten Zellzuständen exprimiert werden: 1) Enzyme, die Licht (Biolumineszenz) produzieren können, das mit einer hochempfindlichen Kamera außerhalb des intakten Kopfes eines lebenden Tieres detektiert wird, und 2) fluoreszierende Farbstoffe, um die Zellen auch auf Gewebeschnitten später wieder identifizieren zu können.



Funktionsfähigkeit des Systems

Die Verlässlichkeit des Systems wurde zunächst in vitro in der Zellkulturschale getestet. Dabei wurde sichergestellt, dass die Menge der Bildgebungsreporter mit dem Grad des Differenzierungszustands der Zellen übereinstimmt, wie er mit biochemischen Methoden bestimmt wird. Sowohl auf RNA- als auch auf Protein-Ebene konnte diese Korrelation gezeigt werden. Im Anschluss wurde in der Zellkulturschale der Entwicklungszustand der Zelle mittels der Bildgebungsreporter im Zeitverlauf präzise beobachtet. Anhand dieser Ergebnisse wurde die schematische Darstellung der Entwicklung der Stammzellen entworfen [Abb. 1].

Im lebenden Tier die Reifung von implantierten Stammzellen darstellen

Im nächsten Schritt konnte die Entwicklung der Stammzellen in vivo im lebenden Gehirn mit einer hochempfindlichen Kamera bis hin zum ausgewachsenen Neuron verfolgt werden. Dazu wurde die Zunahme des Biolumineszenz-Signals über mehrere Wochen nach Implantation von Stammzellen in den Kortex von Maushirnen beobachtet. Während das Stadium der frühen neuronalen Differenzierung nach etwa 4-5 Wochen erreicht war (Abb.2), wurden mehrere Monate benötigt, bevor sich im Kortex völlig ausgereifte Neurone aus den implantierten Stammzellen gebildet hatten, wie mit Hilfe des Bildgebungsreporters für voll differenzierte Neurone beobachtet werden konnte. Dieses Signal unter Kontrolle des Synapsin Promoters weist darauf hin, dass die neu gebildeten Neurone beginnen, sich ins Netzwerk des Hirngewebes zu integrieren.

Voll funktionsfähige Neurone

Die Funktionsfähigkeit der neu gebildeten Nervenzellen wurde elektrophysiologisch im Labor von Prof. Peter Kloppenburg (Biocenter, Zoologie-Institut, Universität zu Köln) mit patch-clamp-Technik nachgewiesen [Abb. 3]. Mit Hilfe von Ableitungselektroden an der differenzierten Stammzelle wurden die elektrischen Impulse gemessen. Die Impulse waren vergleichbar mit DCX positiven Zellen in der Subventrikular Zone nach Schlaganfall [7].

Ausblick

Die hier vorgestellte In-vivo-Bildgebungsmethode ermöglicht es erstmals die Differenzierung der Stammzellen nach ihrer Implantation live zu verfolgen. Auf diese Weise können erstmalig Aufschlüsse gewonnen werden, mit welchen Mechanismen die Stammzellen ihre therapeutischen Wirkungen entfalten. Zudem können messbare Therapieerfolge gleichzeitig mit der Entwicklung der implantierten Zelle im Gehirn korreliert werden. So kann hier mehr Klarheit für die wichtige Frage erwartet werden, ob für die therapeutische Wirkung eher eine parakrine Wirkung der Stammzellen oder eine neuronale Integration ins Hirngewebe erforderlich ist.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren kann jedes Tier individuell in Longitudinalstudien wiederholt zu verschiedenen Zeitpunkten einer Studie untersucht werden. Dies hat den Vorteil, dass die Anzahl der Versuchstiere in Zukunft deutlich reduziert werden kann ohne Einschränkung der wissenschaftlichen Qualität der Untersuchungen, ein bedeutsamer positiver Effekt für die Tierversuchsethik. Abschließend darf darauf hingewiesen werden, dass dieses In-vivo-Bildgebungsverfahren übertragbar ist auf beliebige, andere zellspezifische Promotoren, so dass viele biomedizinische Fragestellungen, insbesondere in der Therapie-Entwicklung, beantwortet werden können.

Zusammenfassung

Die präsentierte Arbeit beschreibt ein völlig neues Verfahren, die Entwicklung von Stammzellen zu funktionsfähigen Neuronen „live" im Gehirn zu verfolgen. Dabei werden Bildgebungsreporter verwendet, die in Abhängigkeit des Entwicklungsgrads der Zelle in der Zelle selbst gebildet werden und mit hochempfindlichen Kamerasystemen außerhalb des Körpers nachweisbar sind. Dieses neue Verfahren ist von Bedeutung für die zukünftige Entwicklung von Stammzell-basierten Therapie-Strategien.

Referenzen
[1] Shichita T. et al.: Journal of neurochemistry 123 Suppl 2, 29-38 (2012)
[2] Moskowitz M.A. et al.: Neuron 67, 181-198 (2010)
[3] Marler J.R. und Goldstein L.B.: Science 301, 1677 (2003)
[4] Lindvall O. und Kokaia Z.: Trends in pharmacological sciences 30, 260-267 (2009)
[5] Darsalia V. et al.: The European journal of neuroscience 26, 605-614 (2007)
[6] Rota Nodari L. et al.: PloS one 5, e14035 (2010)
[7] Liu, X.S. et al.: Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 29, 297-307 (2009)

Kontakt
Prof. Dr. Mathias Hoehn

In-vivo-NMR Labor
Max Planck Institut für Stoffwechselforschung, Köln

Dr. Annette Tennstaedt
In-vivo-NMR Labor
Max Planck Institut für Stoffwechselforschung, Köln

Weitere Artikel zum Thema Neurobiologie

Kontaktieren

MPI f. Neurologische Forschung
Gleueler Str. 50
50931 Köln
Deutschland
Telefon: +49 221 472 0

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.