Antikörper-Toolbox für die Lebensmittelanalytik

Aktuelle Trends und Herausforderungen für automatisierte Lösungen

  • Abb. 1: Ablauf eines ELISAsAbb. 1: Ablauf eines ELISAs
  • Abb. 1: Ablauf eines ELISAs
  • Abb. 2: Schematischer Aufbau eines impedimetrischen Immunsensors
  • Abb. 3: Sensoren der Fa. Testo, Lenzkirch
  • Abb. 4: Dendrogram einiger Aspergillus spp.
  • Tab. 1: Selektivitäten/Kreuzreaktivitäten ausgewählter monoklonaler Antikörper
  • Tab. 2: Methodenvergleich zur Schimmelpilzdetektion  (*Daten aus Literaturangaben)
  •  Dr. Irene Schmilinsky
  •  Prof. Dr. Christine Wittmann
Christine Wittmann1, Irene Schmilinsky1
 
Verunreinigte, veränderte und falsch deklarierte Lebensmittel können die Gesundheit des Verbrauchers massiv beeinträchtigen. Deshalb gibt es gesetzliche Grenzwerte und Vorgaben, die von jedem Lebensmittelhersteller einzuhalten sind. Ferner ist dem Wunsch der Verbraucher nach jederzeit abrufbaren Produktinformationen zu entsprechen. Hierdurch ergeben sich spannende Herausforderungen für eine rasche und kostengünstige Analytik. Antikörper-basierte Systeme sind zu diesem Zweck hervorragend geeignet.
 
Instrumentelle Analytik- Von A wie Allergen über M wie Mykotoxin bis Z wie Zusatzstoff
 
Während es in früheren Jahrhunderten wichtig war eine ausreichende Zufuhr an wesentlichen Nahrungsbestandteilen wie Eiweiß, Fett und Kohlenhydraten sicherzustellen und gefährliche Keime sowie toxische Substanzen wie z. B. Schimmelpilzgifte zu vermeiden, ist mittlerweile eine gesundheitsbewusste, nach Möglichkeit lebensverlängernde Ernährung bei vielen Verbrauchern in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. Die Vielzahl an Analysemethoden, mit welchen immer niedrigere Nachweisgrenzen erreicht werden, trägt dem ebenso Rechnung wie die installierten Qualitätskontrollmechanismen. So verfügt die Lebensmittelindustrie bereits über ein umfangreiches Portfolio an automatisierten in-line-Verfahren, mit denen das Lebensmittelprodukt jederzeit sowohl bezüglich verschiedener physikalischer Parameter (wie z. B. pH-Wert und Temperatur) als auch in der chemischen Zusammensetzung charakterisiert werden kann. So werden u. a. während der Produktion NIR-Sensoren eingesetzt, welche berührungslos den Gehalt an Wasser / Trockenmasse, Eiweiß, Fett und Kohlenhydraten messen, so dass Abweichungen von Normwerten quasi-online festgestellt werden können. Spuren von Rückständen wie z. B. Pestiziden, Antibiotika und Hormonanaloga sowie Kontaminationen mit Schwermetallen sind mit diesen Systemen meist nicht nachweisbar. Daher sind gängige Standardmethoden zur Erfassung einer Vielzahl an Analyten nach wie vor chromatographische Trennverfahren (wie v. a.

HPLC und GC) meist gekoppelt mit einem spektroskopischen Nachweis (wie v. a. der Massenspektrometrie). Die Detektion des Analyten erfolgt hier im Vergleichsverfahren nach der Auftrennung der Probe anhand substanzspezifischer Eigenschaften. Der große Vorteil dieser Analytik liegt in der Vielzahl von Methoden und umfangreichen Datenbanken zur Auswertung. So wurden in internationaler Zusammenarbeit verschiedene Massenspektrendatenbanken etabliert, in denen sogenannte Fingerprintspektren von Proteinen gespeichert wurden wie z. B. von Bakterien [1] oder aber in jüngerer Zeit von Nutztieren [2]. Zur Tierartidentifizierung ersetzen mittlerweile häufig DNA-basierte Verfahren wie die real-time PCR (polymerase chain reaction) die aufwändige Proteinanalytik. Dabei wird die Ziel-DNA aus der Probe extrahiert, aufgereinigt und die Vervielfältigung online mit Hilfe ausgewählter Fluoreszenzfarbstoffe verfolgt. Einige Probleme bleiben bei allem Fortschritt aber bei all diesen Techniken bestehen: die Geräte sind teuer, haben einen hohen Platzbedarf und erfordern gut geschultes Personal zu ihrer Bedienung. Die instrumentelle Analytik ist damit aufwändig und kostenintensiv. Darüber hinaus werden zumeist organische Lösungsmittel benötigt, welche sachgerecht entsorgt werden müssen. Eine häufige Fehlerquelle ist oft auch der nicht selten immense Aufwand für die Probenvorbereitung. Kleine und mittelständige Unternehmen verfügen meist nicht über die erforderlichen Geräte. Einhalten müssen sie die gesetzlichen Bestimmungen trotzdem. Daher werden die Analysen oft bei Privatlaboratorien in Auftrag gegeben, was neben den Kosten zu einer gewissen Abhängigkeit führt. Es besteht daher ein Bedarf an kostengünstigen und einfach durchzuführenden Alternativen, welche sich nach Möglichkeit automatisieren lassen.

 
Chancen für Antikörper als analytisches Reagenz
 
Körperfremde Verbindungen wie z. B. Influenza-Viren lösen beim Menschen und Wirbeltieren eine Immunantwort aus, in deren Folge passgenaue Antikörper gegen diese sogenannten Antigene gebildet werden. Antikörper sind Glykoproteine, welche mit ihren Haftstellen körperfremde Proteine binden. Aber auch Substanzen, gegen die üblicherweise aufgrund ihrer niedrigen Molekülmasse keine Antikörperbildung ausgelöst wird (sogenannte Haptene) können, gekoppelt an ein Trägerprotein, eine Immunantwort bewirken. Auf diese Weise lassen sich analytische Antikörper gezielt auch gegen Pestizide, Mykotoxine, Antibiotika und weitere Verbindungen gewinnen. An diese analytischen Antikörper werden diverse Anforderungen gestellt. Sie müssen in ausreichend großer Menge hergestellt werden können, eine hohe Affinität zu ihrem jeweiligen Antigen/Hapten aufweisen und in gleichbleibender Qualität vor allem in Bezug auf ihre Spezifität bereitgestellt werden können. Monoklonale Antikörper erfüllen diese Anforderungen am besten.
 
Enzymimmunoassay und Teststreifenformat
 
Analytische Antikörper besitzen eine Vielzahl an Einsatzmöglichkeiten. So tragen bei der Mykotoxinanalytik Antikörper-basierte Affinitätssäulen zur Voranreicherung des Analyten dazu bei, die Messempfindlichkeit der instrumentellen Analytik deutlich zu verbessern. Bei anderen Analyten wie z. B. genetisch veränderten Organismen [3], Lebensmittelallergenen [4] oder Schimmelpilzen können Antikörper-basierte Testsysteme wie Enzymimmunoassays die ansonsten aufwändige Proteinanalytik ersetzen. So wird für den Lebensmittelbereich eine Vielzahl an Verfahren und kommerziell erhältlichen Testkits auf Basis polyklonaler und monoklonaler Antikörper angeboten. Abbildung 1 zeigt schematisch das 
Messprinzips eines ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Dieses Verfahren lässt sich in Mikrotiterplatten, aber auch auf Teststreifen durchführen. Dazu werden zwei verschiedene Antikörper benötigt, die unterschiedliche Bereiche der Antigenstruktur erkennen. Einer der Antikörper, der an eine Festphase gebunden wird, wirkt dabei als Fänger, der andere, der mit einem Enzym (bzw. mit Goldnanopartikeln im Teststreifenformat) verknüpft ist, als Detektor. Die Antigen-Antikörper-Bindung wird durch eine Farbreaktion nachgewiesen. Im Falle des Mikrotiterplattenformats wird die Farb-reaktion durch das an den Detektorantikörper gebundene Enzym katalysiert. Häufig wird als Enzym Meerrettichperoxidase eingesetzt. Dieses Enzym katalysiert die Oxidation von Tetramethylbenzidin (TMB), das eine charakteristische Blaufärbung aufweist. Durch Vermittlung von Peroxidase wird TMB unter sauren Bedingungen von Wasserstoffperoxid zu einem stabilen, gelben Diimin-Derivat oxidiert. Die Farb-intensität hängt dabei davon ab, wieviel Meerrettichperoxidase über die Antikörper-Antigen-Antikörper-Wechselwirkung an die Oberfläche gebunden wurde. Die Farbintensität wird photometrisch bei 450 nm erfasst. Mit Hilfe einer Standardkurve lässt sich dann die Antigenkonzentration ermitteln. Für eine semi-quantitative Bestimmung sind Teststreifenformate geeignet, welche eine rasche Vor-Ort-Analyse ermöglichen. So kann nach einer kurzen Extraktion einzelner Pflanzenteile bereits auf dem Feld festgestellt werden, ob es sich um gentechnisch veränderte Pflanzen handelt [3]. 
 
Impedimetrischer Immunsensor
 
Antikörper können auch immobilisiert auf funktionalisierten Sensoroberflächen eingesetzt werden und erlauben so eine Automatisierung der Methode. Das Grundprinzip des in Abb. 2 dargestellten Sensormessstreifens beruht darauf, dass der Analyt (wie beispielsweise Allergene oder Schimmelpilze) mit selektiven und sensitiven monoklonalen Antikörpern direkt aus der Testprobe herausgefischt wird. Die monoklonalen Antikörper werden dazu über ein leitfähiges Polymer an eine Sensoroberfläche gebunden. Der so hergestellte Messstreifen steht dann für die automatisierte Messung bereit. Sobald sich in der Probe Spuren des gesuchten Analyten befinden, werden durch die Bindung an den Antikörper die elektronischen Eigenschaften der Oberfläche verändert. Dies kann als elektrische Signaländerung beispielsweise in der Cyclovoltammetrie oder der Impedanzmessung erfasst werden. Ein ganz wesentlicher Schritt ist dabei die Sensorfunktionalisierung, welche wiederum vielfach vom Elektrodenmaterial abhängig ist. Hier lassen sich für die Immobilisierung von Antikörpern die gleichen Immobilisierungsverfahren wie auch für DNA-Chips und DNA-Sensoren einsetzen [5]. Abbildung 3 zeigt eine Auswahl an Sensoren.
 
Schimmelpilzfrüherkennung als Anwendungsbeispiel
 
Schimmelpilze sind ubiquitär in der Umwelt vorhanden und kommen demzufolge auch auf Lebensmittelrohstoffen wie u. a. Obst, Getreide, Kaffeebohnen und Gemüse vor. Schimmelpilze wie beispielsweise Aspergillen und Penicillium-Spezies können nicht nur allergische Reaktionen beim Menschen auslösen. Ihre Stoffwechselprodukte, die Mykotoxine, sind bereits in sehr niedrigen Spurenkonzentrationen hochwirksame Leberzellgifte und können nephrotoxisch wirken. Daher wurden von der EU für etliche Mykotoxine (wie u. a. die Gruppe der Aflatoxine, Fusarientoxine, Ochratoxin A, Patulin) restriktive Grenzwerte für das Vorkommen in Lebensmitteln und Futtermitteln festgesetzt [6]. Im Rahmen des HACCP-Konzeptes (Hazard Analysis of Critical Control Points = Gefahrenanalyse mit Hilfe kritischer Lenkungspunkte) sowie weiterer Standards wie IFS (International Featured Standards) und BRC (British Retail Consortium) ist es den Lebensmittelherstellern daher ein Grundanliegen, das Vorhandensein der Schimmelpilze bereits zum frühestmöglichen Zeitpunkt zu erkennen und entsprechend kontaminierte Rohstoffe für die Produktion auszuschließen. Im Rahmen des Projektes Mykotest wurde erfolgreich eine Serie monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Ochratoxin A- sowie Patulin-produzierende Schimmelpilze entwickelt und in größeren Mengen hergestellt (Tabelle 1). Die gewonnenen Antikörper wurden in Folge mit Hilfe eines ELISA-Tests hinsichtlich ihrer Spezifität und Sensitivität charakterisiert. Die monoklonalen Antikörper waren nicht nur für einen spezifischen Nachweis einzelner Aspergillus- sowie Penicillium-Spezies geeignet. Vielmehr gelang es auch, monoklonale Antikörper zu identifizieren, welche einen Gruppen-spezifischen Schimmelpilznachweis erlauben. Die Messung von Realproben sowohl aus dem Backwarenbereich (u. a. Toastbrot) als auch von Obst (z. B. Weintrauben) ergab, dass vor allem Aspergillen nachgewiesen werden konnten, bevor sie visuell zu erkennen waren. Diese Detektion gelang auch mit den parallel etablierten DNA-basierten Verfahren wie der Real-time PCR. Allerdings erfordert die Real-time PCR einen im Vergleich deutlich höheren Aufwand bei der Probenvorbereitung und ist demzufolge zeit- sowie auch kostenintensiver. Als weitere Methode kann auch die MALDI-ToF-Massenspektrometrie eingesetzt werden vorausgesetzt, es steht eine umfangreiche Schimmelpilzspektren-Bibliothek zur Verfügung. Zur Erstellung neuer Datenbankeinträge wurden ebenfalls im Rahmen des Projektes Mykotest die Schimmelpilze in Reinkultur für die Vermessung mit dem MALDI-ToF-MS-Gerät hergestellt. Nach der Kultivierung wird das Pilzmyzel direkt vom Agar auf einen kleinen Probenträger (Target) aufgetragen und dort mit einer Matrix gemischt, die zur Ionisierung der Analytmoleküle erforderlich ist. Nach der Trocknung des Matrix-Analytgemischs entsteht eine kristalline Probe. Diese wird im Hochvakuum des Massenspektrometers mit kurzen Laserpulsen beschossen, so dass die Matrixmoleküle und auch Analytmoleküle aus der Kristalloberfläche herausgelöst und in die Gasphase überführt werden. Durch Kollision der neutralen Analyt- mit den Matrixmolekülen kommt es zur Ladungsübertragung, so dass die Analytmoleküle ionisiert werden. In der feldfreien Strecke des langen Vakuum-Flugrohres können sie dann aufgrund ihrer unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgetrennt werden und erreichen den Detektor nach unterschiedlichen Flugzeiten. Die auftreffenden Ionen werden registriert und durch Kalibrierung des Systems mit Ionen bekannter Masse kann das Massenspektrum der Probe ermittelt werden. Abbildung 4 zeigt ein Dendrogram zur Auswertung. Auch mit MALDI-ToF-MS wurden Realproben vorwiegend aus dem Obstbereich untersucht. Obwohl sich der jeweilige Schimmelpilzbefall bei Vorliegen eines entsprechenden Dateneintrags sehr gut verifizieren ließ, stehen die hohen Kosten einem routinemäßigen Einsatz entgegen. Tabelle 2 zeigt einen Methodenvergleich. Dabei ist ersichtlich, dass sich die Antikörper-basierten Methoden für einen raschen Nachweis eignen. Weitere Vorteile sind, dass Antikörper mit vergleichsweise geringem Aufwand in automatisierten Anwendungen eingesetzt werden können. Im Falle der Schimmelpilzfrüherkennung bedeutet dies weiterhin, dass neben dem online-Nachweis von Schimmelpilzen bei dem Vorliegen spezifischer Antikörper die Analytik auch auf die Mykotoxine ausgedehnt werden kann. Dies ist auch das Ziel eines aktuell durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Energie aufgrund eines Beschlusses des Bundestags geförderten ZIM-Projektes. Der Schwerpunkt liegt dabei in der Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen Patulin, Alternariol und Tenuazonsäure sowie in einem neuen automatisierten Messsystem für die direkte Messung von Schimmelpilzen und Mykotoxinen in flüssigen Lebensmittelproben.
 
Ausblick
 
Sowohl der Verbraucher als auch die Lebensmittelindustrie haben großes Interesse an automatisierten in-line-Lösungen für die Analyse von Lebensmitteln auf Inhalt und Frische. Neben der Überwachung der Produktion werden zunehmend miniaturisierte Sensoren ein Faktor in der Produktwerbung. Für die Überwachung der Kühlkette und der Frische bestimmter Produkte etablieren sich mehr und mehr sogenannte intelligente Verpackungen, die per Smartphone-App oder Farbwechsel Zusammensetzung, Herstellerdaten oder Frische ihres Inhalts anzeigen. Auch die Analysendaten sollten heutzutage jederzeit verfügbar und auch von jedem Ort abrufbar sein. Viele Verbraucher nutzen bereits die Möglichkeit per App über einen Code auf dem Lebensmittelprodukt neben der Kennzeichnung weitere Informationen über das Lebensmittel zu erhalten. In jüngerer Zeit gibt es diverse Smartphone-Anwendungen vor allem für den medizinischen Bereich [7]. Ansätze direkt für den Verbraucher ermöglichen es z. B. für Freizeitsportler, über eine App ihren Trainingsstatus quasi online mit Hilfe eines NFC (near-field communication)-fähigen Smartphones zu erfassen. Dabei lassen sich viele Parameter wie z. B. der Kortisonspiegel nicht nur im Blut sondern auch in einer Speichelprobe mit Hilfe spezifischer Antikörper messen. Die so zur Verfügung stehenden Trainingsdaten können gespeichert bzw. auch zur weiteren Interpretation an Sportmediziner und/oder Ernährungswissenschaftler übermittelt werden. Solche Anwendungen sind auch für den Lebensmittelbereich reizvoll, bei denen in Zukunft sicher auch Antikörper-basierte Sensoren eine Rolle spielen werden.
 
Zugehörigkeit
1Hochschule Neubrandenburg, Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften, Neubrandenburg
 
Kontakt
Prof. Dr. Christine Wittmann
Hochschule Neubrandenburg
Fachbereich Agrarwirtschaft 
und Lebensmittelwissenschaften
Neubrandenburg
wittmann@hs-nb.de
 
Lebenslauf
Dr. Irene Schmilinsky
Die Diplomchemikerin Dr. Irene Schmilinsky promovierte an der TU-Berlin und am Fraunhofer IBMT in Potsdam Golm zum Thema Biosolarzelle. Danach arbeitete sie in der R&D-Abteilung der Hamilton-Bonaduz-AG in der Schweiz im Bereich Lab & Sensors an der Entwicklung optischer Prozesssensoren. Anschließend schloss sie wiederum am IBMT ein Projekt zur photochemischen Modifizierung von Oberflächen für die in-vitro-Diagnostik ab bevor sie an der Hochschule Neubrandenburg ihre derzeitigen Aufgaben am Projekt „MykotoxSens“ übernahm.
 
Lebenslauf
Prof. Dr. Christine Wittmann
Prof. Wittmann wurde 1996 für das Lehrgebiet Lebensmittelchemie an die Hochschule Neubrandenburg berufen. Seit 2004 leitet sie das Steinbeis-Transferzentrum „Bioprozessanalytik in der Lebensmittelproduktion“. Frau Wittmann hat sich bereits während der Promotion mit der Antikörperherstellung sowie als wissenschaftliche Assistentin mit der Biosensorentwicklung beschäftigt. Ihr Forschungsschwerpunkt liegt in der Entwicklung biochemischer Schnelltests und Biosensoren für die Lebensmittel- und Umweltanalytik sowie die medizinische Diagnostik.
 
Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/category/tags/lebensmittelanalytik
 

Literatur:

[1]http://spectra.folkhalsomyndigheten.se/spectra/database/bruker.action;jsessionid=B34AA454C25A5D6802CADFEFE3D1B8CD

[2]https://dl.dropboxusercontent.com/u/8384843/Homepage/CVUAS_Rau_Stoll_Poster_Tierarten_MALDITOFMS.pdf

[3]a) Walschus U., Witt S. Wittmann C.: Food & Agric. Immun. 14(4), 232-240, 2002

b) Wittmann C.: Labor & More, 4, 58-59, 2008

[4] Albrecht B., Hartwich S., Wen Z., Wittmann C.: Labor & More, 3, 55-57 2010

[5] a) Wittmann, C. „DNA immobilization“ in: Encyclopedia of Analytical Chemistry, 2012

b) Wittmann, C. (editor): Immobilization of DNA on Chips I, Topics in Current Chemistry, Vol. 260, Springer Verlag Berlin Heidelberg 2005, 195 ff

c) Wittmann, C. (editor): Immobilization of DNA on Chips II, Topics in Current Chemistry, Vol. 261, Springer Verlag Berlin Heidelberg 2005, 199 ff

[6] http://eur-lex.europa.eu/legal-content/DE/TXT/PDF/?uri=CELEX:32006R1881&...

[7] Ehrensberger C.: Nachrichten aus der Chemie, 64, 38-40, 2016

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