Trihydroxyfettsäuren

Natürliche Fungizide und Konservierungsstoffe

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  • Abb. 1: Enzymkaskade zur Bildung von TriOH in Pflanzen
  • Abb. 2: Labor-Synthese von TriOH key: 9S-HPODE: 9-(S)-hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic acid LOX: lipoxygenase POX: peroxigenase  HPI: hydroperoxide isomerase EH: epoxide hydrolase   CH: chemical hydrolysis  R1 = (CH2)7COOH, R1= C5H11
  • Abb. 3: Hemmtest mit 9S,12S,13S-Trihydroy-10E-octadecensäure auf das Wachstum der Schimmelpilze Alternaria alternata (A) bzw. Cladosporium Spezies (B)
Leif-Alexander Garbe1, Fabien Schultz1
 
Oxigenierte Lipide wie zum Beispiel Trihydroxyfettsäuren nehmen eine relevante Rolle im Mechanismus der natürlichen Pflanzenabwehr ein. In der Vergangenheit wurde vereinzelt deren bioaktive Eigenschaften, wie etwa antifungaler, bakteriozider, anti-viraler oder insektizider Aktivität beschrieben.
 
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung dieser biologischen Fungizide auf Basis von Trihydroxyfettsäuren für die Anwendung bei der Lagerung und Verarbeitung von Lebensmitteln sowie auf dem Feld. Damit kann der Schutz von Mensch, Tier und Umwelt wesentlich verbessert werden.
 
Biozide
Ernteverluste in der Landwirtschaft können häufig direkt mit dem Befall durch Mikroorganismen in Verbindung gebracht werden. Weiterhin besteht eine relevante Gesundheitsgefahr für Mensch und Tier durch gesundheitsgefährdende mikrobielle Metabolite wie z. B Aflatoxine. Insbesondere „Biolebensmittel“, die nicht oder nur extrem eingeschränkt mit chemischen Pflanzenschutzmitteln (PSM) behandelt werden dürfen, sind unter diesem Aspekt relevant [1]. Folglich richten Forschungsinstitutionen weltweit ihre Aufmerksamkeit nun vermehrt auf die Entdeckung und Herstellung neuer natürlicher Biozide. Diese neuartigen Zusatzstoffe und Biozide sind natürlichen Ursprungs, das heißt werden idealerweise in Pflanzen biologisch erzeugt und sind daher deklarierungsfrei in (Bio-)Lebensmitteln einsetzbar. Vor allem der Pilzbefall ist in der Landwirtschaft sowie bei der Lagerung und Produktion von Nahrungsmitteln ein Problem. Neben einem eingeschränkten Wachstum der Nutzpflanzen und damit geringerer Erträge, können durch den Befall mit Schimmelpilzen gesundheitsschädliche bzw. giftige Stoffwechselprodukte gebildet werden. Fungizide sind biologische oder chemische Wirkstoffe, die Pilze oder ihre Sporen abtöten beziehungsweise ihr Wachstum behindern. Der Wunsch nach biologischem Pflanzenschutz, insbesondere in der Bundesrepublik Deutschland, ist in den letzten Jahren gewachsen und verstärkt sich weiterhin durch den Bedarf an Bio-Lebensmitteln.

Eine Vielzahl der heute in der Landwirtschaft eingesetzten Fungizide sind chemischen Ursprungs und bergen in höheren Konzentrationen Umwelt- und Gesundheitsrisiken und der Verbraucher wünscht sich in zunehmendem Maße Lebensmittel, die „völlig frei“ von PSM-Rückständen sind. Dieses ist mit den herkömmlichen PSM kaum zu bewältigen, dennoch werden die Grenzwerte in aller Regel eingehalten. Für Bio-Lebensmittel, die vielerorts auf dem Vormarsch sind, gibt es keine zugelassenen chemischen PSM. Im Gegenzug führt das Wachstum von Schimmelpilzen auf Bio-Lebensmitteln in der Folge von fehlenden PSM zu einem gesteigerten Gesundheitsrisiko für den Verbraucher, der sich vermeintlich gesund mit Bio-Produkten ernährt bzw. ernähren will. Die Anwendung natürlicher Fungizide hingegen kann helfen die Belastung von Umwelt und Verbrauchern mit künstlichen Fungiziden zu verringern ohne auf einen effektiven Schutz vor Pilzbefall zu verzichten. Trihydroxy-octadecensäuren könnten hier vielversprechende Kandidaten sein.

 
Ergebnisse
Eigene Vorarbeiten zeigten die Bildung eines einzigen Stereoisomers der möglichen 16 Trihydroxyoctadecensäure-Isomere während des Maischens [2]. Der enzymatische Weg ist regio- and stereoselektiv und könne einen Signalweg in Gerste darstellen, der stressbedingt ausgelöst wird (Abb. 1). Die 9S,12S,13S-Trihydroxy-10E-octadecensäure wurde mit 55 mg / kg nach dem Maischen in deutlich höherer Konzentration gefunden, als der normale Gesamt-THOE-Gehalt von 18 mg/kg [3]. Für dieses Isomer wurde bspw. eine antimykotische Wirkung gegen den Auslöser des Reisbrands Magnaporthe grisea [4] beschrieben. 
 
Die Biosynthese läuft beginnend mit der Linolsäure über einen stereoselektiven Bildungsweg mit einem lipoxygenasekatalysierten Oxygenierungsschritt zu Hydroperoxiden, gefolgt von einer durch Epoxyalkoholsynthase katalysierten Epoxydierung und anschließender Hydrolyse in Gegenwart einer Epoxidhydrolase ab. Aufgrund der häufig beobachteten vermehrten Bildung von bestimmten TriOH-Isomeren nach biotischem oder abiotischem Stress und der Beteiligung des Lipoxygenase-Reaktionswegs an der Pflanzenabwehr, wurde eine antimykotische und antimikrobielle Wirkung der TriOH vereinzelt angenommen. Die antifungale Wirkung auf den Pilz Magnaporthe grisea können unsere aktuellen Arbeiten jedoch nur bedingt bestätigen [5].
 
Chemo-enzymatische Synthesemethoden
Zur Herstellung von isomerreinen TriOH und TriOH-Isomerengemischen wurde sich an den biologischen Prozessen orientiert und der Syntheseweg ist in Abbildung 2 dargestellt. 
 
Die Tomate erwies sich als idealer LOX-Lieferant mit ausschließlicher Katalyse der 9-HPODE-Entstehung. Die Isolierung von LOX aus Tomate und Gerste sowie die Klonierung des LOX-Gens und Transformation in E.coli sind Gegenstand aktueller Forschungsarbeiten. Die weitere Umsetzung der 9-HPODE zu den korrespondierenden Epoxyalkoholen kann über verschiedene Wege ebenfalls enzymatisch oder nicht-enzymatisch katalysiert ablaufen, wobei der Reaktionsmechanismus entweder homo- oder heterolytisch ist. Bislang wurde im Projektverlauf die auf den Oxygenierungsschritt folgende Bildung der Epoxyole lediglich chemisch katalysiert durch Hämatin/Hämoglobin mit anschließender Säurehydrolyse durchgeführt. Im Ergebnis entstand ein Gemisch aus verschiedenen Isomeren (9,10,13- / 9,12,13-TriOH), welches aufgereinigt oder direkt in den mikrobiologischen Versuchen getestet wurde. In Zukunft wird ebenfalls die Umsetzung von 9-HPODE durch eine Hydroperoxid-Isomerase von Saprolegnia parasitica oder durch eine Hydroperoxid-abhängige Peroxigenase von Vicia faba zu Epoxyalkoholen untersucht. Enzymatisch werden die gebildeten Epoxyole durch EH zu TriOHs hydrolysiert, dabei kommt es fast immer zur Akkumulation eines bestimmten Isomers [6].
 
Biotechnologische Produktion
An der Hochschule Neubrandenburg wurde eine kostengünstige Methode zur Herstellung von wirksamen, wässrigen TriOH-Gemischen entwickelt. Sie soll im Prinzip von jedem Landwirt einfach und schnell direkt durchgeführt werden und basiert direkt auf der Stressinduktion und Initiierung der natürlichen Biosynthese. Die hergestellte wässrige TriOH-Lösung enthält zum großen Teil das Isomer 9S,12S,13S-Trihydroy-10E-octadecensäure sowie kleine Teile anderer Isomere. 
 
Mikrobiologische Hemmtests
Die antifungale Testung der TriOH-Reinisomere sowie zur Untersuchung synergistischer Effekte ebenfalls Isomerengemische und Gerstenextrakte erfolgt durch standardisierte Agarplattendiffusionstests und einen Microtiterplatten-Assay mit photometrischer Auswertung. Die Palette getesteter Mikroorganismen umfasst regional und weltweit relevante pflanzenpathogene Pilzstämme wie beispielsweise Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Magnaporthe oryzae sowie ebenfalls verschiedenste Bakterienstämme. 
 
Abb. 3 zeigt die Wirkung des Isomers 9S,12S,13S-Trihydroy-10E-octadecensäure auf das Wachstum der Schimmelpilze Alternaria alternata (A) bzw. Cladosporium Spezies (B), welches das dominante Isomer in den biotechnologisch hergestellten wässrigen Gerstenproben ist. Bereits bei einer Konzentration von 0,5 mM TriOH ist das Wachstum der Pilze deutlich gehemmt. Im weiteren Projektverlauf werden Versuche auf in Klimaschränken angebauten und mit relevanten phytopathogenen Pilzen infizierten Pflanzen unter TriOH Applikation und anschließend Feldversuche durchgeführt.
 
Ausblick
Gegenstand der weiteren Arbeiten ist die Klärung des Wirkmechanismus der Oxilipine auf die Pilze und Testung verschiedener Isomere auf weitere Pilze. 
 
Danksagung
Dieses Vorhaben wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung unter der Nummer FKZ 03FH025IX4 OxiLiFungi finanziell gefördert. Wir danken unseren Projektpartnern Prof G. Flick & Prof. K. Steffens sowie den wissenschaftlichen Mitarbeiterinnen Z. Sadykova, J. Caesar & M. Müller für die Unterstützung.
 
Zugehörigkeiten
1Angewandte Chemie, Chemie biogener Rohstoffe und Produkte, Lebensmittelwissenschaften, Hochschule Neubrandenburg
 
Kontakt
Prof. Leif-Alexander Garbe 
Angewandte Chemie
Chemie biogener Rohstoffe und Produkte
Lebensmittelwissenschaften
Hochschule Neubrandenburg 
Neubrandenburg
garbe@hs-nb.de
 
Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/
 
Mehr Informationen: http://www.git-labor.de/
 

Literatur
1. Verordnung (EG) Nr. 834/2007: Zugelassene Pflanzenschutzmittel,

2. Leif-Alexander Garbe, Holger Hübke, Roland Tressl, Enantioselective Formation Pathway of a Trihydroxy Fatty Acid During Mashing J. Am. Soc. Brew. Chem. 63(4):157-162, (2005), DOI: 10.1094/ASBCJ-63-0157

3. Garbe, L.-A.; Barbosa de Almeida, R.; Nagel, R.; Wackerbauer, K.; Tressl, R.: Dual Positional and Stereospecificity of Lipoxygenase Isoenzymes from Germinating Barley (Green Malt): Biotransformation of Free and Esterified Linoleic Acid. J. Agric. Food Chem., 54, 946-955, (2006), DOI: 10.1021/jf051993t

4. Tadahiro Kato, Yoshihiro Yamaguchi, Tadao Uyehara, Toshiro Yokoyama, Tsuneo Namai, Susumu Yamanaka: Self defensive substances in rice plant against rice blast disease: Tetrahedron Lett., 43, 4715–4718, (1983), DOI: 10.1016/S0040-4039(00)86236-X

5. Hiroyuki Ohta, Kan Shida, You-Liang Peng, Iwao Furusawa, Jiko Shishiyama, Shigeo Aibara and Yuhei Morita: A Lipoxygenase Pathway Is Activated in Rice after Infection with the Rice Blast Fungus Magnaporthe grisea, Plant Physiol., 97, 94-98, (1991)

6. Hamberg, M., and Hamberg, G.: Peroxygenase-catalyzed fatty acid epoxidation in cereal seeds – sequential oxidation of linoleic acid into 9(S),12(S),13(S)-trihydroxy-10(E)-octadecenoic acid. Plant Physiol. 110:807-815, (1996)

 
 
 

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