Das Phänomen (Durchfluss)-Zytometrie

Eine wichtige Technik in der biomedizinischen Forschung

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  • Abb. 1: Allgemeiner Arbeitsablauf eines FACS-Experimentes. Ein durchflusszytometrisches Experiment besteht aus mehreren Schritten mit verschiedenen Optionen. Am Anfang steht die Planung: welche Proben (a) und welche Geräte (b) müssen oder können verwendet werden. Die Geräte-Ausstattung und die Fragestellung bestimmen, welche Reagenzien eingesetzt werden können (c). Je nach Experiment und Art der Proben müssen die Zellen präpariert, vereinzelt und vor der FACS-Messung vorangereichert werden (d). Bei der Messung müssen die Geräteeinstellungen optimiert sowie vorhandene spektrale Überlappungen korrigiert werden (e). Die Datenauswertung fußt auf der richtigen Darstellung der Werte und der Analyse mit sinnvollen statistischen Mitteln (f). Die Ergebnisse fließen oft in eine Optimierung der experimentellen Planung ein (a).
  • Abb.2: Durchflusszytometrische Methoden. In der klassischen Durchflusszytometrie werden die Proben normalerweise mit Fluoreszenz-Farbstoff markierten Antikörpern gefärbt und in einem Flüssigkeitsstrom an einem Laserfokus vorbeigeleitet. Die entstehenden Fluoreszenzsignale werden detektiert und ausgewertet (a). Bei der Image-Zytometrie werden zusätzlich noch mikroskopische Bilder (Fluoreszenz- und Durchlicht) gespeichert (b). In der Massen-Zytometrie werden die Zellen mit seltenen Erden statt Fluoreszenzfarbstoffen markiert, zu einem Plasma verdampft und in einem Massenspektrometer gemessen (c).
  • Abb. 3: Neue Methoden zur Analyse multidimensionaler Datensätze. Um komplexe Datensätze mit über 30 Parametern mit den üblichen Dotplots auszuwerten, müsste man fast 500 Plots analysieren (a). Durch High dimension reduction (HDR) gelingt es Auswerteroutinen wie z.B. t-SNE5 und anderen, die komplexen Datensätze intuitiv auswertbar zu machen (b) (www.flowjo.com). Ausgehend von einem solchen Plot, kann wieder detailliert in die einzelnen Subpopulationen gezoomt werden (c) (www.flowjo.com).

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die (Durchfluss)zytometrie von einer Nischenanwendung für Immunologen zu einer wichtigen und weit verbreiteten Labortechnik in der biomedizinischen Forschung und darüber hinaus entwickelt. Die neuen Möglichkeiten bieten nicht nur Chancen, sondern erfordern auch ein Umdenken bei der Planung, Durchführung und Auswertung von durchflusszytometrischen Experimenten.

Durch Fortschritte in der Laser- und Computertechnik, sowie durch die Entwicklung neuer Fluoreszenzfarbstoff-Klassen wurde die Anzahl der zu messenden Parameter pro Zelle von 6 auf aktuell 20, in der neuesten Gerätegeneration sogar auf 30 Parameter nahezu verfünffacht. Dabei liegt die Limitation nicht bei den Geräteherstellern, die mit manchen Instrumenten schon ≥ 50 Parameter messen könnten, sondern bei der Verfügbarkeit sinnvoll kombinierbarer Fluoreszenzfarbstoffe.

Zusammen mit einer realistischen Durchflussrate von 10.000 – 30.000 Zellen pro Sekunde und der Möglichkeit, die Zellen physikalisch mit einem Zellsorter in verschiedene Populationen aufzutrennen, macht die hohe Anzahl an Parametern diese Methode für die Wissenschaft so interessant. Immer mehr rücken die Vorgänge und Veränderungen in einzelnen Zellen in den Fokus. Man möchte u.a. verstehen, wie sich individuelle Tumore verhalten und aus welchen Zellpopulationen sie sich zusammensetzen. Damit hofft man besser vorhersagen zu können, welche Therapien am aussichtsreichsten sind und warum sich Resistenzen gegen bestimmte Behandlungen entwickeln. Diese Vorgänge kann man nur abbilden, wenn man das Zusammenspiel der verschiedenen Subpopulationen auf Einzelzellebene untersucht. War früher die FACS-Messung1 Endpunkt eines Experimentes, so ist sie heute eingebettet in eine Vielzahl aufeinander abgestimmter Analysen (z. B. Gen- oder Proteinexpressionsstudien). Die Chance, solche Fragen zu beantworten, hat die Entwicklung enorm beschleunigt. Inzwischen gibt eine nicht gekannte Vielfalt an Instrumenten und zytometrischen Produkten.

Einfluss der Reagenzien und Geräteeinstellungen

Die Umsetzung und Durchführung einer durchflusszytometrischen Messung wird oft unterschätzt.

Ein Experiment besteht aus vielen Schritten und Variablen, die sich gegenseitig und damit auch das Endergebnis beeinflussen (Abb. 1). FACS-Daten sind in hohem Maß von der Qualität der verwendeten Reagenzien und den für die Datenakquisition verwendeten Geräteeinstellungen abhängig. Zudem sind die Messwerte relativ und können nur im experimentellen Kontext sinnvoll interpretiert werden. Bei einer Distanzangabe von 500 m hat man normalerweise keine Probleme, sich die Strecke konkret vorzustellen. Sagt man jedoch: Die Probe hat einen Wert von 12.300 MFI (Mean/Median Fluorescent Intensity)2, erntet man vermutlich nur Unverständnis. Der Wert 12.300 MFI bekommt erst eine konkrete Bedeutung, wenn man auch die Werte der korrespondierenden Kontrollen kennt. Hat die Negativ-Kontrolle einen Wert von z. B. 1200 MFI, so leuchtet die Probe ca. 10x heller. Liegt deren Wert allerdings bei 12.000 MFI, so scheint die Probe nicht signifikant über dem Hintergrund zu liegen. Ohne entsprechende Kontrollen ist ein FACS-Experiment deshalb schwer, u. U. gar nicht sinnvoll zu interpretieren. Dies gilt vor allem auch für die Korrektur der spektralen Überlappung, der sogenannten Kompensation3. Da bei steigender Anzahl an Parametern pro FACS-Messung die spektralen Überschneidungen notwendigerweise zunehmen, werden auch immer mehr Einzelfärbekontrollen nötig, um diese richtig zu kompensieren.

Reproduzierbarkeit von Ergebnissen

Ein zunehmendes Problem in der Durchflusszytometrie ist die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen. Vor-15-20 Jahren gab es mehrheitlich 2-Laser-Systeme, die alle ähnlich ausgestattet waren. Die Laser hatten die gleiche Anregungswellenlänge mit vergleichbarer Stärke und auf Detektionsseite arbeitete man mit denselben Filtern. Wurde in einer Publikation die Nomenklatur FL-1, FL-2, FL-3, usw. zur Bezeichnung der Fluoreszenzkanäle benutzt, dann war diese Bezeichnung für fast alle Geräte gleich und konnte als allgemein bekannt toleriert werden. Das hat sich heute geändert.

Wie oben bereits beschrieben gibt es inzwischen eine Vielzahl an unterschiedlichen Geräten und Gerätekomponenten in zahllosen Kombinationen. Durch einfache Filterwechsel auf der Detektionsseite lässt sich zudem ein Instrument schnell individuell verändern. In Publikationen ist es daher nicht mehr ausreichend, die Kanäle mit FL-1, FL-2, usw. zu bezeichnen. Allerdings hat sich die Praxis in den Veröffentlichungen noch nicht ausreichend geändert. So bleibt es oft schwer nachvollziehbar, unter welchen Voraussetzungen genau die Daten generiert wurden. Schon vor Jahren haben Experten der Internationalen Gesellschaft zur Förderung der Zytometrie (ISAC4) diese Problematik diskutiert und notwendige Richtlinien zu Publikationsstandards veröffentlicht [1,2].

Kombination der Durchflusszytometrie mit anderen Methoden

In der (translationalen) Forschung ist das Probenmaterial häufig limitiert und nicht unbegrenzt verfügbar (z.B. Biopsie eines seltenen Tumors). Je mehr Informationen man daraus generieren kann, desto effektiver wird das Material genutzt. Das hat u.a. auch dazu geführt, die Durchflusszytometrie als Methode weiter zu entwickeln und mit anderen Anwendungen zu kombinieren. Hier sind zwei Beispiele: Es existieren inzwischen bildgebende Zytometer, welche die Mikroskopie mit der Durchflusszytometrie zur „Image-Zytometrie“ zusammenführt [3]. Werden zur Markierung von Antigenen seltene-Erden-Metalle statt Fluoreszenzfarbstoffe benutzt, kann man diese anschließend in einem Massenspektrometer analysieren („Massen-Zytometrie“) [4] (Abb. 2). Mit diesen Methoden werden heute schon über 30 Parameter pro Zelle erfasst. Wollte man diese Datenmenge auf dem herkömmlichen Weg mit 2D-Dotplots auswerten, müsste man fast 500 dieser Plots manuell auswerten (Abb. 3). Dass dies nicht mehr mit den etablierten Analysenwerkzeugen bewerkstelligt werden kann, liegt nahe. Aus diesem Grund wurden neue Softwareapplikationen entwickelt, um der wachsenden Datenkomplexität gerecht zu werden. Im Prinzip wird versucht die Zellen über alle Messparameter hinweg zu vergleichen und ähnliche Datensätze möglichst nahe beieinander anzuordnen. D.h. im Umkehrschluss je unterschiedlicher die Zellen sind, desto weiter liegen sie auf einem Plot entfernt (Abb. 3). Auf diesem Weg ist es möglich, die vorhandenen Dimensionen zu reduzieren und komplexe Datensätze einer intuitiven Analyse zuzuführen [5].

Ausblick

Um diese neuen Ansätze in Zukunft sinnvoll und effektiv umzusetzen, bedarf es des Austausches zwischen den Anwendern. In Deutschland entsteht unter der Initiative einiger Core Facility Leiter und DGfZ6-Mitglieder gerade die neue Online-Plattform „cytometry.de“, die diesen Austausch fördern und Anlaufstelle sein soll, um aktuelle Methoden, Fragen und Probleme in der Zytometrie zu diskutieren.

Endnoten

1FACS steht im Englischen für Fluorescence activated cell sorting und ist seit 1985 ein registrierter Markenname der Firma Becton Dickinson: US Patent and Trademark Office; Reg. No. 1.367.436; Oct. 29, 1985.
2Die Mean Fluorescent Intensity (MFI) oder durchschnittliche Fluoreszenzintensität einer Messung wird als Kanalnummer angegeben und bezeichnet die relative Helligkeit der Probe. Je intensiver die Probe leuchtet, desto größer ist der MFI-Wert.
3Fluoreszenzfarbstoffe haben oft ein breites Emissionsspektrum und werden deshalb in mehreren Kanälen detektiert, was dort zu falsch positiven Signalen führt. Diese müssen mathematisch korrigiert – sprich kompensiert – werden.
4ISAC: International Society for Advancement of Cytometry.
5t-SNE: t-stochastic neighboring embedding.
6DGfZ: Deutsche Gesellschaft für Zytometrie.

Autor
S. Schmitt

Kontakt
Dr. Steffen Schmitt
Leiter Zytometrie Core Facility
Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)
Heidelberg, Deutschland
steffen.schmitt@dkfz.de

Referenzen
[1] Lee, J. A., et al., Cytometry A 2008. 73: 926–930. DOI: 10.1002/cyto.a.20623.
[2] Spidlen, J., et al., Current Protocols in Cytometry 2012. 10.18.1 – 10.18.26. DOI: 10.1002/0471142956.cy1018s61
[3] Zuba-Surma, E., et al., Folia Histochemica et Cytobiologica 2007. 45: 279-290. PMID 18165167
[4] Bendall, S., et al., Science 2011. 332: 687-696. DOI: 10.1126/science.1198704
[5] Van der Maarten, L., Journal of Machine Learning Research 2008., 9: 2579-2605.

 

Deutsche Gesellschaft für Zytometrie

Multiparameter-Durchflusszytometrie

 

Kontaktieren

Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)
Im Neuenheimer Feld 280
69120 Heidelberg, Baden-Württemberg
Deutschland
Telefon: 06221-42-1261

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