Enzyme

Selektivität nutzbar machen

  • Abb. 1: (A) Wertschöpfungskette bei der Synthese von Naturstoffen mit Hilfe von Enzymen. (B) Umsetzung eines prochiralen Ketons (2 = Grundchemikalie) zu den beiden stereoisomeren Alkoholen (S-3 und R-3 = chirale Bausteine) und daraus abgeleitete Synthese von (S)-5-Hexadecanolid, einem Insektenpheromon (S-5 = Naturstoff) [10].Abb. 1: (A) Wertschöpfungskette bei der Synthese von Naturstoffen mit Hilfe von Enzymen. (B) Umsetzung eines prochiralen Ketons (2 = Grundchemikalie) zu den beiden stereoisomeren Alkoholen (S-3 und R-3 = chirale Bausteine) und daraus abgeleitete Synthese von (S)-5-Hexadecanolid, einem Insektenpheromon (S-5 = Naturstoff) [10].
  • Abb. 1: (A) Wertschöpfungskette bei der Synthese von Naturstoffen mit Hilfe von Enzymen. (B) Umsetzung eines prochiralen Ketons (2 = Grundchemikalie) zu den beiden stereoisomeren Alkoholen (S-3 und R-3 = chirale Bausteine) und daraus abgeleitete Synthese von (S)-5-Hexadecanolid, einem Insektenpheromon (S-5 = Naturstoff) [10].
  • Abb. 2: (A) Substrat-basierte Stereokontrolle bei der Umsetzung von Verbindung 6 [11]. (B) Beispiel für eine asymmetrische Reduktion, bei der die Substratkontrolle nicht greift [7]. (C) Reduktion des Cyclohexenons 10 mit enantiokomplementären Enzymen, welche von Reetz et al. durch gerichtete Evolution erzeugt wurden [12].
  • Abb. 3: Mutagenesestrategien zur Generierung von enantiokomplementären Enzymen.

Naturstoffe stehen nach wie vor im Fokus wissenschaftlicher Disziplinen. Vor allem die pharmakologische Wirkung vieler Substanzen ist für die Popularität verantwortlich und führt zu einem verstärkten Interesse an der Entwicklung von Synthesestrategien für diese außergewöhnlichen Moleküle.

Naturstoffe weisen in ihrer Struktur oft einen hohen Grad an Komplexität auf, was sich in ihrer Größe, der Vielfalt ihrer funktionellen Gruppen und der Anzahl der stereogenen Zentren widerspiegelt. Die Natur geht die Selektivitätsprobleme bei deren Synthese mit scheinbar spielender Leichtigkeit durch Enzyme, hoch selektive Biokatalysatoren, an. Es liegt daher nahe, diese beeindruckenden Maschinerien als Werkzeuge für die effiziente Synthese von Naturstoffen nutzbar zu machen.

Auch im Arbeitskreis Pietruszka am Institut für Bioorganische Chemie der Heinrich Heine Universität Düsseldorf im Forschungszentrum Jülich beschäftigen sich Forscher verstärkt mit der Verwendung von Enzymen als Synthesekatalysatoren [1-8]. Dabei wird versucht aus einfachen Grundchemikalien wertvolle chirale Bausteine zu generieren, welche schließlich zu Naturstoffen kombiniert werden können (Abb. 1A). Durch den Einsatz von Biokatalysatoren ist es möglich, Syntheserouten zu verkürzen, Produktausbeuten zu erhöhen und enantiomerenreine Substanzen zu generieren [9]. Eine Hürde stellt oftmals die natürliche Enantioselektivität des Enzyms selber dar. Was macht man, wenn das Enzym nicht das gewünschte Enantiomer generiert? In den folgenden Abschnitten wird am Beispiel von Reduktasen gezeigt, welche Strategien es gibt, um das benötigte Enantiomer erhalten zu können.

Natürliche enantiokomplementäre Enzyme
Im einfachsten Fall kann man auf stereokomplementäre Enzyme aus dem Pool der Natur zurückgreifen. Auf diese Strategie wurde bei der Synthese von (S)-5-Hexadecanolid [(S)-5] zugegriffen. Dieses Insektenpheromon wird aus einem δ-Laktonenantiomer 4 synthetisiert, wohingegen das andere Enantiomer wiederum zu zytotoxischen Goniothalaminen umgesetzt werden kann. In einem klassischen Syntheseschritt wird hierzu zunächst ein prochirales Keton erzeugt, welches dann zu einem chiralen Alkohol reduziert und anschließend laktonisiert wird.

Diese Reduktion kann durch eine Alkoholdehydrogenase (ADH) geschehen, was eine aufwändige Schutzgruppenstrategie und viele Syntheseschritte umgeht. Verwandte enantioselektive, klassische Reduktionen waren nicht zielführend. Durch ein Screening von 28 ADHs aus verschiedenen Organismen, konnten zwei Enzyme identifiziert werden, die hoch selektiv (ee > 99 %) jeweils ein Enantiomer des Alkohols bilden. ADHLB aus Lactobacillus sp. erzeugt mit einer Ausbeute von 92 % das (S)-Enantiomer, während ADHT aus Thermoanaerobacter sp. das (R)-Enantiomer liefert (Ausbeute 87 %). Nach erfolgreicher Laktonisierung lassen sich durch weitere Syntheseschritte das Pheromon (S)-5-Hexadecanolid [(S)- 5] auf Basis des (R)-Enantiomers synthetisieren, sowie – ausgehend vom (S)-Enantiomer – verschiedene Goniothalamin-Derivate. Mit Hilfe der ADH ließen sich die Totalsynthesen also nicht nur deutlich verkürzen, sondern konnten auch, verglichen mit einer Syntheseroute ohne Biokatalysator, die Ausbeuten der enantiomerenreinen Alkohole mehr als verdoppelt werden [10].

Substrat-Engineering
Neben der Möglichkeit, die Stereokontrolle bei einer Reaktion dem beteiligten Enzym zuzuweisen, kann auch durch das Substrat selbst eine Einflussnahme auf die Konfiguration des Produktes erfolgen. Eine Differenzierung durch das Enzym kann dabei entweder über die Geometrie des Substrates geschehen (E/Z-Isomere) oder durch die Größe einzelner Substituenten, die durch das Einbringen von Schutzgruppen variiert werden können [7,11]. Bei den Enoatreduktasen, welche durch elektronenziehende Gruppen aktivierte Doppelbindungen reduzieren können, erfolgt eine Koordinierung der aktivierenden (Carbonyl-)Gruppe im aktiven Zentrum. Während der Reduktion findet eine Addition eines Hydrids an den β-Kohlenstoff und eine antiständige Addition eines Protons an den α-Kohlenstoff statt. Die Koordinierung ist dabei fix und ein „Umdrehen“ der Doppelbindung führt dann auch zum umgekehrten Stereozentrum, welches durch die Reduktion aufgebaut wird. Ein solches „Umdrehen“ kann dadurch realisiert werden, dass anstatt des (E)-Eduktes das (Z)-Edukt verwendet wird. Faber et al. zeigen dies für die Verbindung 6. Während die Umsetzung von (Z)-6 mit sehr guten Enantiomerenüberschüssen (S)-7 liefert, wird (E)-6 zu (R)-7 umgesetzt (Abb. 2A). Bei Verbindung 8 ging diese Strategie im Arbeitskreis in Jülich jedoch nicht auf. Sowohl die (E)-Verbindung als auch die (Z)-Verbindung wurde zum (R)-Enantiomer 9 umgesetzt, was auf eine unterschiedliche Aktivierung, entweder über das Keton für (E)-8 oder die Estergruppe bei (Z)-8, im Enzym zurückzuführen ist.

Enantiokomplementäre Enzyme durch Mutagenese
Substrat-Engineering ist also nicht immer eine Lösung und leider tut uns die Natur auch nicht immer den Gefallen, stereokomplementäre Enzyme wie am Beispiel der ADH zu „liefern“. Durch Mutagenese können aber auch die natürlichen Eigenschaften eines Enzyms dahingehend verändert werden, dass das gewünschte Produkt gebildet wird [12,13]. Man bedient sich hier des darwinistischen Prinzips, in dem iterativ durch Zyklen von Mutagenese und Selektion genau die Eigenschaften des Enzyms herausgebildet werden, welche man benötigt. Grundsätzlich unterscheidet man hier zwei Vorgehensweisen (Abb. 3): Bei der gerichteten Evolution (directed evolution) wird eine große Zahl von Mutanten mit zufälligen Mutationen im gesamten Gen erzeugt. Beim rationalen Enzymdesign tritt der zufällige Charakter in den Hintergrund, da durch Wissen um die Struktur und den Mechanismus des Enzyms gezielte Mutanten konzipiert werden. Dies schränkt den späteren Screening-Aufwand im Gegensatz zur gerichteten Evolution deutlich ein. Hierbei können jedoch auch scheinbar „irrationale“ aber zielführende Lösungen gar nicht identifiziert werden. Ein Beispiel hierfür sind Mutationen, welche durch Fernwirkung das aktive Zentrum beeinflussen (remote effect) und durch rationales Design häufig nicht gefunden werden.

Im Bereich der Enoatreduktasen gibt es eine erfolgreiche Anwendung der oben beschriebenen gerichteten Evolution, bei der die Stereoselektivität der Enoatreduktase YqjM umgekehrt werden konnte. Im Fall der Enoatreduktasen gibt es zwar natürliche Varianten, die für einzelne Reaktionen eine umgekehrte Stereoselektivität aufweisen, jedoch handelt es sich mehr um Exempel als um den Regelfall [14]. Auch sind die natürlichen Mechanismen dieser Selektivität zu wenig verstanden, als dass davon gegenwärtig Regeln abgeleitet werden könnten [15]. So konnte in einem als CASTing (combinatorial active-site saturation test) bezeichneten Prozess die Stereoselektivität des Enzyms de novo umgekehrt werden. Im Jahre 2009 identifizierten Reetz et al. Hierzu, zunächst anhand einer Kristallstruktur von YqjM, 20 Positionen in räumlicher Nähe der Substratbindetasche, die sie einer iterativen Sättigungsmutagenese (ISM) unterzogen [12,13]. Bei dieser Methode werden in einem ersten Zyklus die entsprechenden Gen-Sequenzen für die 20 Aminosäuren in die Ursprungssequenz des Enzyms eingebracht, sodass im Idealfall alle Permutationen an der bestreffenden Stelle realisiert werden. Mutanten dieser ersten Generation, die in Screenings eine Verbesserung der gewünschten Eigenschaften zeigen, werden anschließend systematisch an weiteren identifizierten Positionen mutagenisiert. Abb. 3: Mutagenesestrategien zur Generierung von enantiokomplementären Enzymen.

Im Falle von YqjM gelang es Reetz et al. auf diese Weise innerhalb von nur zwei Zyklen sowohl (R)- als auch (S)-selektive Mutanten für die Umsetzung des Modelsubstrates 3-Methylcyclohexenon zu erzeugen (Abb. 2C). Gleichzeitig wurde eine drastische Erhöhung des Umsatzes erzielt. Auffällig war ebenfalls, dass viele Mutanten bereits nach der ersten Sättigungsmutagenese erhöhte Enantioselektivitäten aufwiesen, die durch kooperative Effekte nach dem zweiten Zyklus noch verstärkt wurden. Auch für nahe strukturverwandte Derivate der Verbindung 10 zeigten sich diese Mutanten enantiokomplementär, leider jedoch nicht für strukturell weniger ähnliche Substrate. Trotz des vertieften mechanistischen und strukturellen Verständnisses stellt auch diese Methode keine universelle Lösung dar und bedarf weiterer Anstrengungen im Spannungsfeld zwischen Biokatalyse und Strukturbiologie.

Zusammenfassung
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Enzyme beeindruckende Biokatalysatoren sind, welche aufgrund ihrer hohen Chemo-, Regio- und vor allem Stereoselektivitäten reizvolle Alternativen zu chemischen Katalysatoren in der Synthesechemie darstellen. Die strikte Enantioselektivität hat aber auch den Nachteil, dass nicht immer das gewünschte Enantiomer auf Anhieb erzeugt werden kann. In den vorangegangen Abschnitten konnte jedoch gezeigt werden, dass dieses Problem durch mannigfaltige Strategien angegangen werden kann. Hier und da hält die Natur schon den passenden Katalysator in ihrem Repertoire bereit – und dieses Repertoire ist groß. Selbst wenn sich so kein geeignetes Enzym identifizieren lässt, lassen sich viele Enzyme durch geschickte Mutagenese auf die eigenen Synthesebedürfnisse maßschneidern. Auch durch Variationen im Substrat, welche im Endprodukt nicht mehr zum Tragen kommen, lassen sich Enzyme manchmal austricksen, sodass diese letztendlich doch das gewünschte Produkt liefern.

Literatur
[1] Pietruszka J. und Schölzel M.: Adv. Synth. Catal. 354, 751-756 (2012)
[2] Bongen P. et al.: Chem. Eur. J. 18, 11063-11070 (2012)
[3] Pietruszka J. und Wang C.: ChemCatChem 4, 782- 785 (2012)
[4] Hoffmann N. et al.: Adv. Synth. Catal. 354, 959-963 (2012)
[5] Kullartz I. und Pietruszka J.: J. Biotechnol. 161, 174–180 (2012)
[6] Hamzic M. et al.: Chirality 23, E110-E115 (2011)
[7] Korpak M. und Pietruszka J.: Adv. Synth. Catal. 353, 1420-1424 (2011)
[8] Bischop M. et al.: Synthesis 527-537 (2010)
[9] Fischer T. und Pietruszka J.: Top. Curr. Chem. 297, 1-43 (2010)
[10] Fischer T. und Pietruszka J.: Adv. Synth. Catal. 354, 2521-2530 (2012)

Weitere Literatur ist direkt bei den Autoren erhältlich.

 

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