Fertigungsverfahren für das Tissue Engineering

Mit Mikro- und Nano-Strukturen zum humanem Gewebeersatz

  • Abb. 1: Verfahren der Laserstrukturierung (A) und der Diamantzerspanung (D); SEM-Aufnahmen der mikro- und nano-strukturierten Oberfläche zur Initiierung der mechanotransduktiven Differenzierung von hMSCs zu Muskelzellen (B) und zu neuronalen Zellen (E); Immunhistochemische Aufnahme von muskulär induzierten (C) und neuronal induzierten hMSCs (F) auf der entsprechenden Struktur. Abb. 1: Verfahren der Laserstrukturierung (A) und der Diamantzerspanung (D); SEM-Aufnahmen der mikro- und nano-strukturierten Oberfläche zur Initiierung der mechanotransduktiven Differenzierung von hMSCs zu Muskelzellen (B) und zu neuronalen Zellen (E); Immunhistochemische Aufnahme von muskulär induzierten (C) und neuronal induzierten hMSCs (F) auf der entsprechenden Struktur.
Claudia Skazik-Voogt1, Thomas Bastuck1,  Andreas Janssen1,  Angela Gutermuth1
 
Nano- und mikrostrukturierte Oberflächen können als Induktor zur Differenzierung von Stammzellen in spezifische Gewebezellen genutzt werden. Um dieses Verfahren für die Herstellung von Gewebeersatz nutzen zu können, müssen die Strukturen großflächig produziert werden. Durch industrielle Verfahren wie Laserstrukturierung oder Diamantzerspanung können die mikro- und nano-gerillten Flächen in großem Maßstab durch schnelle und preiswerte Fertigungsprozesse hergestellt werden. 
 
Bedarf nach großen Mengen differenzierter Zellen – eine Herausforderung für das Tissue Engineering 
 
Zur Behandlung von Gewebeverletzung oder Gewebeverlust werden bisher vorwiegend allogene Transplantate eingesetzt. Diese bringen jedoch zahlreiche Nachteile mit sich: die Spendermaterialien unterliegen oft Qualitätsschwankungen, Patienten müssen lange auf ein immunkompatibles Transplantat warten, erleiden häufig Abstoßungsreaktionen und müssen lebenslang gesundheitsbelastende Immunsuppressiva einnehmen. Weniger problematisch sind autologe Transplantate, die beispielsweise mit Hilfe des Tissue Engineerings hergestellt werden und langfristig allogene Transplantate ersetzen können. Zur Herstellung der autologen Transplantate sind sowohl ein geeignetes Scaffoldmaterial als auch eine geeignete Zellquelle notwendig. Stammzellen eignen sich aufgrund ihres hohen Proliferations- und Differenzierungspotentials als Zellquelle. Diese haben jedoch den Nachteil, dass sie aufgrund ihrer hohen Plastizität in vivo oft in unerwünschte Geweberichtungen differenzieren [1]. Daher besteht ein großer Bedarf die Stammzellen vor Besiedelung des Scaffolds in vitro in weniger plastische Zielgewebezellen zu differenzieren [2]. Zur Stammzelldifferenzierung werden traditionell liquide xenogene Differenzierungsfaktoren eingesetzt [2], die nebenwirkungsreich sind und hohe Kosten verursachen [3]. 
 
Eine Alternative bietet die mechanotransduktive Differenzierung.

Dabei nimmt die Zelle durch eine integrinrezeptorvermittelte Adhäsion die Topographie und Steifigkeit der angrenzenden Mikroumgebung wahr. Dieser extrazelluläre mechanische Stimulus wird in ein biochemisches Signal umgewandelt, wodurch die Stammzellen einen entscheidenden Impuls zur Differenzierung erfahren. Einwirkende physikalische Kräfte, wie beispielsweise Stretch- oder Scherstress, werden über spezifische Rezeptoren der Zellen wahrgenommen und führen zur Aktivierung verschiedener intrazellulärer Signalkaskaden. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Genexpression in humanen adulten Stammzellen durch Mechanotransduktion beeinflusst werden kann [4, 5]. Die Mechanotransduktion wird teilweise durch eine intrazelluläre Spannung vermittelt, die durch das Actin-Myosin-basierte Zytoskelett aufgebaut wird und kann letztlich Einfluss auf den Nukleus nehmen und somit eine Zellwantwort hervorrufen [6]. Durch diese hochkomplexen Vorgänge passt sich die Zelle an wechselnde äußere Einflüsse an, indem die Zellstruktur und Funktion verändert werden. 

 
Dieses Wissen kann genutzt werden um Stammzellen in vitro in spezifische Gewebezellen zu differenzieren [7]. Dazu werden gezielt Mikro- und Nanotopographien auf biokompatible Materialien aufgebracht, auf denen die Zellen anschließend differenzieren. Die größte Herausforderung bei dieser Technologie liegt jedoch darin, dass die topographisch modifizierten Substrate nur in sehr kleinem Maßstab hergestellt werden können. Da die angewendeten Strukturierungsprozesse sehr zeit- und kostenintensiv sind, können diese Verfahren bisher nur in der Forschung und im Prototypmaßstab eingesetzt werden. Als Quelle für Gewebeersatz werden jedoch große Mengen vordifferenzierter, gewebespezifischer Zellen benötigt. Bevor das Verfahren für die Herstellung von Ersatzprodukten für eine breite Masse an Patienten genutzt werden kann, muss daher ein Verfahren etabliert werden mit dem Mikro- und Nanostrukturen in großem Maßstab kostengünstig hergestellt werden können. Aus diesem Grund forschen Ingenieure und Biologen daran, industrielle Strukturierungsverfahren für die Herstellung von Topographien für die Stammzellbiologie anzuwenden.
 
Mesenchymale Stammzellen als mechanosensitive Stammzellquelle
 
Zur Untersuchung der mechanotransduktiven Differenzierung auf verschiedenen Oberflächenstrukturen wurden humanem mesenchymale Stammzellen (hMSC) verwendet. Diese wurden zunächst aus humanen Fett- oder Vorhautgewebe isoliert und anschließend durchflusszytometrisch anhand von stammzellspezifischen Oberflächenmarkern phänotypisch im FACS charakterisiert. Die hMSCs weisen eine positive Expression für CD73, CD90, CD105 auf und sind negativ für CD14, CD20, CD34 und CD45. Humane MSCs besitzen eine multipotente Differenzierungskapazität. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass hMSCs sich nicht nur in mesodermale wie adipo-, osteo- und chondrogene Linien differenzieren können, sondern auch die Fähigkeit besitzen zu transdifferenzieren und unter entsprechenden Bedingungen spezifische Marker für endodermale und ektodermale wie myogene und neuronale Linien exprimieren können [8, 9, 10, 11].
 
Verfahren zur Herstellung großflächiger mikro- und nano-strukturierter Oberflächen
 
In Abhängigkeit von der gewünschten Differenzierungsrichtung sind unterschiedlich skalierte Strukturen und Steifigkeiten des Substrats gefordert. Unter diesem Aspekt konnte mit den Verfahren der Laserstrukturierung und der Diamantzerspanung Mikro- und Nanostrukturen hergestellt werden. Die resultierenden Topographien eignen sich zur Initiierung von mechanotransduktiven Differenzierung hMSCs in Muskelzellen oder neuronale Zellen. Dadurch kann weitestgehend auf xenogene Differenzierungsfaktoren verzichtet werden.
 
Die Laserstrukturierung ist ein Bearbeitungsverfahren für Freiformbauteile und kann genutzt werden, um gezielt Mikro- und Nanostrukturen in nahezu alle Werkstoffoberflächen einzubringen. Der Werkstoff wird hier bei sehr hoher Strahlungsintensität und sehr kurzer Pulsdauer verdampft oder sublimiert. Beliebige Strukturen mit lateralen Abmessungen oberhalb von 10 µm werden mittels direkter Laserstrukturierung gefertigt. Zudem lassen sich durch selbstorganisierte Strukturierung kleinere periodische Strukturen mit einer Periodizität bis zu 100 nm erzeugen. 
 
In diesem Fall wurden mit Hilfe der Lasertechnologie Rillenstrukturen zur Muskelzelldifferenzierung in Petrischalen eingebracht. Die Kombination aus dem harten Substratmaterial und der Rillentopographie induziert bei hMSCs die Expression muskelspezifischer Gene, wie z. B. α-Smooth Muscle Actin (SMA), Desmin oder M-Cadherin, die zur Sarkomerbildung notwendig sind. Darüber hinaus wurde eine Zellverschmelzung beobachtet, wie sie bei der Differenzierung in Muskelzellen typischerweise auftritt. Im Vergleich zur Muskelzelldifferenzierung eignen sich für die Initiierung der mechanotransduktiven Differenzierung von hMSCs in neuronale Zellen dagegen besonders kleiner dimensionierte Strukturen, wobei Rillenstrukturen hier besonderes Potential gezeigt haben. Dazu wurde mithilfe eines Diamantzerspanungsverfahrens ein Strukturmuster entwickelt, das parallel angeordnete Mikrorillen und eine definierte Topographie im Nanometerbereich aufweist.
 
Dazu wird zunächst ein Masterwerkzeug hergestellt, in dem die Zielstruktur mit einem konturierten Diamanten auf einem Prägezylinder abgetragen wird. Durch ein Rolle-zu-Rolle-Verfahren kann die Topographie des Masterwerkzeugs, das als Walze fungiert, in einem kontinuierlichen Prägeprozess großflächig auf ein beschichtetes Foliensubstrat übertragen werden. Dabei entspricht die Oberfläche des Werkstoffs dem Negativ des Masterwerkzeuges. Im folgenden Schritt wird die Topographie in synthetische Biomaterialien wie Silikone oder auch zukünftig in natürliche Biomaterialien wie Kollagen abgeformt. 
 
Es konnte bereits gezeigt werden, dass diese gerillten und in Polydimethylsiloxan (PDMS) abgeformten Topographien die neuronale Differenzierung von hMSCs einleiten. Die Zellen exprimieren neuronale Marker wie Neurofilament und β-Tubulin III und Vinculin als einen Marker für fokale Adhäsion. Dabei bleibt auch nach mehrwöchiger Kultivierung der Zellen die gewünschte Zieltopographie erhalten.
 
Zusammenfassung
 
Industrielle Verfahren zur Fertigung strukturierter Oberflächen für das Tissue Engineering gewinnen zunehmend an Bedeutung. Der Vorteil der vorgestellten Strukturierungsmethoden liegt darin, dass große Flächen durch einen schnellen, relativ preiswerten Fertigungsprozess strukturiert werden können. Damit rückt die großtechnische Herstellung von gewebespezifischem Zellersatz aus hMSCs in greifbare Nähe, was ein Novum auf dem Gebiet der Stammzellforschung im biomedizinischen Sektor darstellt.
 
Zugehörigkeit
1Fraunhofer Institut für 
Produktionstechnologie, Aachen
 
Kontakt
Dr. rer. nat. Claudia Skazik-Voogt
Fraunhofer Institut für Produktionstechnologie
Aachen
claudia.skazik-voogt@ipt.fraunhofer.de
 
Mehr zu Tissue Engineering: http://www.git-labor.de/category/tags/tissue-engineering
 
Maschine zur Herstellung von Zuckerwatte hilft beim Tissue Engineering: https://www.nsf.gov/news/special_reports/science_nation/cottoncandycapillaries.jsp?WT.mc_id=USNSF_51

Referenzen
[1] Trefferi A.: Primary myelofibrosis: 2017 update on diagnosis, risk-stratification, and management. Am J Hematol. 91(12): 1262-1271 (2016)
[2] Mikael Häggström: WikiJournal of Medicine, 1(2) (2014)
[3] Mc Namara L.E., Dalby M.J., Tsimbouri M.P.: The use of microarrays and fluorescence in situ hybridization for the study of mechanotransduction from topography.Methods Cell Biol.;119: 293-309 (2014)
[4] Dalby M.J., Gadegaard N., Tare R., et al.: The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat. Mater. 6(12): 977-1003 (2007)
[5] Wang N., Tytell J.D., Ingber D.E.: Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10(1): 75-82 (2009)
[6] Pajerowski J.D., Dahl K.N., Zhong F.L. et al.: Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 104(40): 15619-24 (2007)
[7] Engler A.J., Sen S., Sweeney H.L., Discher D.E.: Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell.;126(4): 677-89 (2006)
[8] Pereira R.F., Halford K.W., O’Hara M.D. et al.: Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92(11): 4857-61 (1995)
[9] Ferrari G.: Muscle Regeneration by Bone Marrow-Derived Myogenic Progenitors. Science 279(5356): 1528-30 (1998)
[10] Kohyama J., Abe H., Shimazaki T. et al.: Brain from bone: efficient ‘meta-differentiation’ of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent. Differentiation 68(4-5): 235-44 (2001)
[11] Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al.: Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7(2): 211–228 (2001)

 

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