Fluoreszenzmikroskopie: Strategien zur Proteinmarkierung

Wer die Wahl hat, hat die Qual

  • Abb. 1: Teilabbildung a illustriert das schematische Vorgehen bei der Markierung von Zielproteinen (POI: protein of interest) mit verschiedenen fluoreszenten Proteinen. Klonierung und Transfektion sind hier jeweils individuell durchzuführende Schritte und führen zu entsprechend markierten Zellen. Gezeigt ist eine konfokale Aufnahme eines cyan-markierten Adenosin A2A-Rezeptors (links; Ex: 442nm, Em: 460-500nm) bzw. eines yellow-markierten Adenosin A2A-Rezeptors (rechts; Ex:514nm, Em: 550-600nm). Teilabbildung b zeigt das schematische Vorgehen bei der Markierung mit einem SNAP-Tag fusionierten Proteins. Das transfizierte Konstrukt wird erst nach Markierung sichtbar. Gezeigt ist ein N-terminal fusionierter SNAP-A2A-Rezeptor, der mit dem Farbstoff SNAP-surface-549 (links; Ex: 561nm, Em: 575-630nm) bzw. SNAP-surface-647 (rechts; Ex: 633nm, Em: 650-700nm) markiert wurde.Abb. 1: Teilabbildung a illustriert das schematische Vorgehen bei der Markierung von Zielproteinen (POI: protein of interest) mit verschiedenen fluoreszenten Proteinen. Klonierung und Transfektion sind hier jeweils individuell durchzuführende Schritte und führen zu entsprechend markierten Zellen. Gezeigt ist eine konfokale Aufnahme eines cyan-markierten Adenosin A2A-Rezeptors (links; Ex: 442nm, Em: 460-500nm) bzw. eines yellow-markierten Adenosin A2A-Rezeptors (rechts; Ex:514nm, Em: 550-600nm). Teilabbildung b zeigt das schematische Vorgehen bei der Markierung mit einem SNAP-Tag fusionierten Proteins. Das transfizierte Konstrukt wird erst nach Markierung sichtbar. Gezeigt ist ein N-terminal fusionierter SNAP-A2A-Rezeptor, der mit dem Farbstoff SNAP-surface-549 (links; Ex: 561nm, Em: 575-630nm) bzw. SNAP-surface-647 (rechts; Ex: 633nm, Em: 650-700nm) markiert wurde.
  • Abb. 1: Teilabbildung a illustriert das schematische Vorgehen bei der Markierung von Zielproteinen (POI: protein of interest) mit verschiedenen fluoreszenten Proteinen. Klonierung und Transfektion sind hier jeweils individuell durchzuführende Schritte und führen zu entsprechend markierten Zellen. Gezeigt ist eine konfokale Aufnahme eines cyan-markierten Adenosin A2A-Rezeptors (links; Ex: 442nm, Em: 460-500nm) bzw. eines yellow-markierten Adenosin A2A-Rezeptors (rechts; Ex:514nm, Em: 550-600nm). Teilabbildung b zeigt das schematische Vorgehen bei der Markierung mit einem SNAP-Tag fusionierten Proteins. Das transfizierte Konstrukt wird erst nach Markierung sichtbar. Gezeigt ist ein N-terminal fusionierter SNAP-A2A-Rezeptor, der mit dem Farbstoff SNAP-surface-549 (links; Ex: 561nm, Em: 575-630nm) bzw. SNAP-surface-647 (rechts; Ex: 633nm, Em: 650-700nm) markiert wurde.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung des Vorgehens bei der Markierung von Zielproteinen (POI: protein of interest) mit Hilfe der „Tetracystein-biarsenical-Tag-Methode“. Das Zielprotein benötigt zur spezifischen Markierung eine CCPGCC-Sequenz. Gezeigt ist eine konfokale Aufnahme eines cyan-markierten Adenosin A2A-Rezeptors, der gleichzeitig eine CCPGCC Aminosäuresequenz enthält. Die Bildkombination links zeigt das Ergebnis nach Zugabe des Farbstoffs FlAsH ohne waschen (oben; Ex: 442nm, Em: 460-500nm; unten Ex: 514nm, Em: 550-600nm), während die Bildkombination rechts die gleichen Zellen nach der Durchführung des Waschprotokolls[8] zeigen (modifiziert nach Referenz [8])

Die Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie hat sich in den letzten Jahren rasant entwickelt und wurde nicht zuletzt durch den Nobelpreis für Chemie im Jahre 2008 für die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins, sowie mit der Verleihung 2014 des Nobelpreises in Chemie für die Überwindung der Auflösungsgrenze nach Ernst Abbe entsprechend akademisch gewürdigt. Dadurch haben sich folgerichtig völlig neue Einblicke in die zelluläre und molekulare Biologie der Zelle ergeben und ein Ende der Entwicklung ist derzeit nicht in Sicht.

Um solche Vorgänge innerhalb von Zellen entsprechend sichtbar zu machen, müssen allerdings die Untersuchungsobjekte entsprechend zielgerichtet markiert werden. Hierfür werden in den allermeisten Fällen Proteine verwendet. Dies geschieht zum einen aufgrund ihrer großen Vielschichtigkeit und wichtigen Bedeutung für die lebenden Zellen. Zum anderen aber auch durch eine derzeit noch stark limitierte Chemie, die für gezielte Markierungsreaktionen an Lipiden oder Nukleinsäuren in lebenden Zellen eingesetzt werden kann.

Zur gezielten Markierung von Proteinen wurden in den letzten Jahren sehr vielfältige Strategien entwickelt, die auf einer Kombination von molekularbiologischen und chemischen Ansätzen beruhen. Von diesen Entwicklungen werden im Folgenden ein paar näher vorgestellt. Die Auswahl ist sicher nicht vollständig, aber doch so gewählt, dass die unterschiedlichen Prinzipien vertreten sind. An den entsprechenden Stellen wird deshalb auf weiterführende Literatur verwiesen.

Genetische Markierung mit fluoreszenten Proteinen

Unter Verwendung der cDNA für die verschiedenen Varianten des grün fluoreszierenden Proteins aus der Qualle Aequorea victoria (oder entsprechender Proteine aus anderen Spezies) lassen sich durch einfache genetische Manipulation leicht sogenannte Fusionskonstrukte herstellen. Solche Konstrukte werden, wie in Abbildung 1a dargestellt, mittels Gentransfer in Zellen transfiziert.

Die entsprechenden Proteine werden dann von der Zelle hergestellt und den Eigenschaften des Proteins folgend im entsprechenden Zellkompartiment lokalisiert und stehen nun für die Untersuchungen zur Verfügung. Der für die Mikroskopie notwendige Fluorophor entsteht dabei durch eine chemische Reaktion innerhalb des fluoreszenten Proteins [1]. In der Regel codiert dabei ein kloniertes Konstrukt für ein zu untersuchendes Protein mit einer Farbe. Soll das zu untersuchende Protein mit einer anderen Farbvariante verbunden sein, ist die Klonierung eines neuen Fusionskonstruktes notwendig (vergleiche Abb. 1a). Dies kann, je nach experimentellen Anforderungen, die Herstellung und Charakterisierung mehrerer Fusionsproteine erfordern und gegebenenfalls auch die Herstellung neuer Zelllinien erforderlich machen. Ein großer Vorteil dieser Markierungsstrategie liegt darin begründet, dass die Proteine den Fluorophor selbst bilden und deshalb keine zusätzlichen Reagenzien verwendet werden müssen. Die Markierung des Zielproteins kann dabei extra- oder intrazellulär erfolgen und mittlerweile existiert eine fast unglaubliche Vielzahl an Farb- und Funktionsvarianten [2], so dass es bereits schwerfällt einen Überblick zu behalten. Allerdings sollte bei diesem Vorgehen nicht vergessen werden, dass die Größe des angefügten fluoreszenten Proteins etwa 230 Aminosäuren beträgt. Dies liegt unter Umständen in einem ähnlichen Größenbereich wie das zu untersuchende Protein selbst. Eine Fusion ist damit oftmals auf den N- bzw. C-Terminus des zu untersuchenden Proteins beschränkt.

Markierungsverfahren mit enzymatischer Aktivität

Eine Weiterentwicklung zur gezielten, aber flexiblen Markierung von Zielproteinen stellen Markierungsverfahren unter Verwendung von modifizierten Enzymen dar. Zwei im Laboralltag weitverbreitete Enzyme, die für solche Markierungen eingesetzt werden, sind der sogenannte SNAP-Tag [3] (kommerzialisiert von NEB) oder alternativ der Halo-Tag (kommerzialisiert von Promega) [4]. Das generelle Prinzip der Markierung und des Vorgehens ist vergleichbar. Wie in Abbildung 1b dargestellt ist, muss zunächst wieder ein Fusionskonstrukt kloniert werden, das analog in Zellen transfiziert wird. Auch hier wird wieder das korrespondierende Protein von der Zelle hergestellt und im entsprechenden Zellkompartiment lokalisiert. Allerdings ist es in diesem Fall nicht möglich das Protein direkt unter Fluoreszenzlicht sichtbar zu machen. Das fusionierte Enzym bildet per se keinen Fluorophor, sondern der Fluorophor muss in einem separaten Inkubationsschritt zu den Zellen gegeben werden und wird dann mit Hilfe der enzymatischen Aktivität kovalent auf das Protein übertragen. Hierbei unterscheiden sich die beiden genannten Tags voneinander. Da es sich im Falle des SNAP-Tag um ein abgewandeltes DNA-Reparaturenzym (O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferase, kurz AGT) handelt, sind die Fluoreszenzfarbstoffe mit einem O6-benzylguanin über einen einsprechenden chemischen Linker fusioniert [3]. Im Falle des Halo-Tag wurde eine bakterielle Haloalkan-Dehalogenase genetisch modifiziert und dadurch für Markierungsverfahren einsetzbar gemacht [4]. Zur Markierung werden entsprechende Halogen-alkane mit dem jeweiligen Fluorophor über eine geeignete Linkerchemie verknüpft. Da die beiden Markierungsverfahren aufgrund der jeweils speziellen Chemie keine Kreuzreaktivität zeigen, können die beiden Verfahren auch verwendet werden um unterschiedliche Proteine in der gleichen Zelle zu markieren und sind daher für den Einsatz bei Vielfarbdarstellungen oder neudeutsch „Multiplexing" geeignet. Ein Vorteil dieser Techniken ist in Abbildung 1b gezeigt. Ein einmal kloniertes Konstrukt lässt sich durch Transfektion in Zellen herstellen und kann dort an der Zelloberfläche, je nach verwendetem Farbstoff, zum Beispiel grün oder rot markiert werden. Allerdings bestehen Einschränkungen bei der Membranpassage von solchen Farbstoffen. Viele organische Fluorophore stellen geladene Verbindungen dar, die aufgrund ihrer Ladung nur eingeschränkt über die Lipidmembran in die Zelle eindringen können. Deshalb können nicht alle Farbvarianten für eine Markierung innerhalb der Zelle eingesetzt werden. Außerdem sind die derzeit meist verwendeten Tags von ähnlicher Größe, wie die bereits erwähnten fluoreszenten Proteine und haben damit die gleichen Limitationen wie dort erwähnt [5].

Kleinere Alternativen zur Markierung

Neben den oben erwähnten Möglichkeiten gibt es alternative Markierungsverfahren für Proteine, bei denen eine kurze Aminosäuresequenz ins Zielprotein eingebracht wird. Der in unserer Arbeitsgruppe bevorzugte Markierungs-Tag besteht aus den sechs Aminosäuren (CCPGCC) und wurde im Labor von Roger Y. Tsien unter dem Namen „Tetracystein-biarsenical-Tag-Methode" entwickelt [6,7]. Diese Aminosäuresequenz ist in der Lage hochselektiv einen kleinen löslichen organischen Fluorophor mit der Bezeichnung FlAsH, (Fluoreszein-arsenical hairpin-binder) zu binden [8]. Allerdings muss hierzu zunächst ein kurzes Markierungsprotokoll abgearbeitet werden, für das etwa 120 Minuten Zeit benötigt werden. Die Prinzipien sind schematisch in Abbildung 2 zum Vergleich dargestellt. Oft wird bei diesem Verfahren behauptet, es sei toxisch für die Zellen, da im Rahmen des Markierungsprotokolls ein arsenhaltiger Farbstoff verwendet wird. Unsere Erfahrungen laufen dem entgegen, da wir Zellen auch noch 6-8 Stunden nach dem Markieren problemlos für unsere Untersuchungen einsetzen können [8]. Wir verwenden diesen Fluorophor gern in Kombination mit Cyan-Farbvarianten, da FlAsH von den spektralen Eigenschaften ein gelb fluoreszierendes Protein ersetzen kann und ein flexibler Einbau an verschiedensten Stellen im Protein möglich ist. Dadurch ergibt sich ein hohes Maß an Flexibilität zur Positionierung innerhalb eines Proteins [8]. Diese Flexibilität stellt eine wesentliche Voraussetzung zur Generierung von Sensoren dar, die zur Untersuchung der Konformationsänderungen nach Ligandenbindung eines Proteins mit Hilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) gebraucht werden [5]. Die Herstellung solcher Sonden und deren Einsatz zur Untersuchung von Pharmaka stellen derzeit einen Hauptschwerpunkt unserer Arbeit dar. Es gibt eine Reihe von Fluorophoren die in Kombination mit der „Tetracystein-biarsenical-Tag-Methode" kompatibel sind, allerdings sind derzeit nur FlAsH und die rote Farbvariante ReAsH käuflich erhältlich.

Ausblick

Die Markierung von Proteinen zum Einsatz in der hochaufgelösten Mikroskopie stellt eine besondere Herausforderung in der Probenvorbereitung dar. Der Experimentator muss bereits sehr früh im Rahmen der Projektplanung eine Auswahl für spätere Markierungsverfahren treffen. Eine goldene Regel und das optimale Markierungsverfahren für alle Anwendungen gibt es derzeit nicht, wohl aber einige generelle Bedingungen und Überlegungen die entsprechend des geplanten Mikroskopieverfahrens in die Auswahl der Markierungstechnik mit einfließen müssen.

Danksagung

Diese Arbeit wurde durch die DFG (SFB487) unterstützt.

Literatur
[1] Shaner NC et al.: J Cell Sci 120(Pt 24): 4247-4260 (2007)
[2] Nienhaus K and Nienhaus GU Chem Soc Rev 43(4): 1088-1106 (2014)
[3] Gautier A et al.: Chem Biol 15(2): 128-136 (2008)
[4] Los GV et al.: ACS Chem Biol 3(6): 373-382 (2008)
[5] Lohse MJ. et al.: Pharmacol Rev 64(2): 299-336 (2012)
[6] Griffin BA et al.: Science 281(5374): 269-272 (1998)
[7] Hoffmann C. et al.: Nat Methods 2(3): 171-176 (2005)
[8] Hoffmann C. et al.: Nat Protoc 5(10): 1666-1677 (2010)

Autoren
Anette D. Stumpf
Carsten Hoffmann

Bio-Imaging-Zentrum
Rudolf-Virchow-Zentrum
Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Universität Würzburg
Würzburg, Deutschland

 

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Universität Würzburg

97074 Würzburg
Germany

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