Genome Editing mittels Cas9-basierter Nukleasen in Pflanzen

Ein anwenderfreundliches Baukastensystem zur zeit- und kostensparenden Herstellung und Programmierung von Genscheren

  • Abb. 1: Verwendung von Cas9 für Genome Editing. Das Erbgut von Pflanzen und Tieren liegt im Zellkern in den Chromosomen vor. Die Genschere Cas9 (violett) mit integrierter guide-RNA (rot) scannt DNA (grün) für Sequenzen mit Komplementarität zu den ersten 20 Nukleotiden der guide-RNA. Findet die Genschere solche Zielsequenzen, so wird der DNA Doppelstrang gespalten. Doppelstrangbrüche werden durch zelleigene Reparaturmechanismen behoben, wobei es zu Modifikationen an der Zielsequenz kommen kann (Inset oben rechts).Abb. 1: Verwendung von Cas9 für Genome Editing. Das Erbgut von Pflanzen und Tieren liegt im Zellkern in den Chromosomen vor. Die Genschere Cas9 (violett) mit integrierter guide-RNA (rot) scannt DNA (grün) für Sequenzen mit Komplementarität zu den ersten 20 Nukleotiden der guide-RNA. Findet die Genschere solche Zielsequenzen, so wird der DNA Doppelstrang gespalten. Doppelstrangbrüche werden durch zelleigene Reparaturmechanismen behoben, wobei es zu Modifikationen an der Zielsequenz kommen kann (Inset oben rechts).
  • Abb. 1: Verwendung von Cas9 für Genome Editing. Das Erbgut von Pflanzen und Tieren liegt im Zellkern in den Chromosomen vor. Die Genschere Cas9 (violett) mit integrierter guide-RNA (rot) scannt DNA (grün) für Sequenzen mit Komplementarität zu den ersten 20 Nukleotiden der guide-RNA. Findet die Genschere solche Zielsequenzen, so wird der DNA Doppelstrang gespalten. Doppelstrangbrüche werden durch zelleigene Reparaturmechanismen behoben, wobei es zu Modifikationen an der Zielsequenz kommen kann (Inset oben rechts).
  • Abb. 2: Ein Baukastensystem für das Genome Editing in Pflanzen. Die DNA-Konstrukte enthalten die fürs Genome Editing benötigten Module flankiert von left/ right border (LB/RB) Sequenzen, welche den Transfer dieses Bereichs in Pflanzenzellen ermöglichen. Für die Module existieren verschiedene Bausteine – so können z. B. die Antibiotika Kanamycin oder Hygromycin, oder aber das Herbizid Basta zur Selektion transformierter Pflanzenzellen verwendet werden, und auch verschiedene Cas9 Module eingesetzt werden. Für individuelle Experimente können bis zu acht guide-RNAs integriert werden.
  • Abb. 3: Erzeugung chromosomaler Deletionen mittels Cas9-basierten Nukleasen. Werden Nukleasen auf benachbarte Zielsequenzen programmiert, so kann es in manchen Fällen zum Verlust des Fragments zwischen den beiden Schnittstellen kommen. Chromosomale Deletionen treten insgesamt seltener als Punktmutationen auf, wobei kleine Deletionen trotzdem mit hohen Frequenzen gefunden wurden. Größere Deletionen von bis zu 120.000 Basenpaaren treten hingegen mit geringen Frequenzen auf.
Die gezielte Veränderung an spezifischen Positionen im Erbgut höherer Organismen, wie Pflanzen und Tieren, wird als Genome Editing bezeichnet. Am Anfang steht dabei stets die Erzeugung eines Doppelstrangbruchs an der Stelle im Chromosom, an der eine Veränderung vorgenommen werden soll. Auf bakteriellen CRISPR / Cas Systemen-basierende Sequenz-spezifische Nukleasen revolutionierten das Genome Editing in den letzten Jahren. Auch in der Pflanzenforschung stehen zunehmend molekulare Werkzeuge zur Verfügung, welche die Verwendung des Genome Editings als Standardtechnik erlauben.
 
Einleitung
 
Heutige Nutzpflanzen sind das Ergebnis tausender Jahre stetiger Selektion: Individuen, die z. B. höheren Ertrag oder erhöhte Resistenz gegen Schädlinge aufweisen, wurden zunächst zur Weiterkultivierung ausgewählt. In modernen Zuchtprogrammen werden durch Kreuzung oder ungerichtete Mutagenese Organismen mit vorteilhaften Eigenschaften generiert - ein zeit- und kostenaufwändiger Prozess mit geringer Vorhersehbarkeit. Daher ist die gezielte Modifikation bestimmter Gene, bzw. deren Ausprägungen, nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern auch in der Züchtung von großem Interesse. Erste „Genome Editing“ Werkzeuge, um bestimmte Bereiche im Genom höherer Organismen gezielt zu verändern, stellten Meganukleasen, Zinkfingernukleasen und TALE Nukleasen dar, waren jedoch in ihrer Anwendung technisch anspruchsvoll. Mit der Erfindung Cas9-basierter Nukleasen [1, 2] veränderte sich diese Situation fundamental.
 
Gezielte Veränderung an spezifischen Positionen im Genom
 
Cas9-basierte Nukleasen leiten sich von CRISPR/Cas Systemen ab, einem in Bakterien und Archaeen vorkommenden, adaptiven Immunsystem [3]. In der biotechnologischen Anwendung bestehen Cas9-basierte Nukleasen aus zwei Komponenten: Zum einen die Genschere, das Cas9 Protein, und zum anderen eine sogenannte „guide-RNA“, welche in die Genschere integriert und diese zum Ziel führt. Um die Genschere zu verschiedenen Zielen im Genom zu lotsen, werden nur die ersten 20 Nukleotide der guide-RNA modifiziert (Abb.

1). Diese 20 Nukleotide leiten das Cas9 Protein über Basenpaarung zu DNA Zielsequenzen, während die übrigen Nukleotide der guide-RNA der Integration in das Cas9 Protein dienen. Soll über Genome Editing nun das Erbgut an einer bestimmten Stelle verändert werden, so wird die Cas9 Genschere über eine passende guide-RNA auf diese Zielsequenz programmiert, wo dann ein Doppelstrangbruch in der DNA erzeugt wird (Abb. 1). Dies führt zur Aktivierung des Organismus-eigenen Reparatursystems: Die freien Enden werden wieder verbunden, wobei häufig kleine Fehler auftreten (Abb. 1) [4]. Somit können z. B. proteinkodierende Gene inaktiviert werden. Alternativ besteht die Möglichkeit der Integration neuer Sequenzen an einer bestimmten Stelle im Erbgut. Derartige „knock-in“ Verfahren sind in pflanzlichen Systemen weiterhin nicht trivial, werden jedoch auch durch einen DNA-Doppelstrangbruch an der gewünschten Insertionsstelle initiiert. So können also über Genome Editing sowohl Gene inaktiviert werden, als auch Gene ersetzt, bzw. repariert oder aber neue Gene hinzugefügt werden. 

 
Für Genome Editing in Pflanzen wird meist ein für die Komponenten kodierendes DNA Konstrukt mittels einer Genfähre, dem Bodenbakterium Agrobacterium, in die pflanzliche Zelle transferiert. Das DNA Konstrukt wird zunächst in das Genom der Pflanze eingebaut. Anschließend werden Cas9 Protein und guide-RNA direkt in der Zelle synthetisiert, und die aktive Genschere entsteht. Die eigentliche Programmierung der Genschere erfolgt somit also durch die Veränderung des zugrunde liegenden DNA Konstrukts.
 
Ein Baukastensystem aus drei Modulen
 
Für eine zeit- und kostensparende Herstellung und Programmierung von Genscheren zum Genome Editing in Pflanzen haben wir ein modulares Klonierungssystem nach dem Baukastenprinzip entwickelt (Abb. 2) [5]. Das Konstrukt, welches in die Pflanzenzelle transportiert wird, muss mindestens drei funktionale Module umfassen. Ein Modul beinhaltet ein Markergen zur Selektion von Zellen, bei denen es zu einer Integration des DNA Konstrukts kam. Ein zweites Modul kodiert für das Cas9 Protein, und ein letztes Modul wird von einer oder mehreren guide-RNA-kodierenden Sequenzen gebildet (Abb. 2). Für die einzelnen Module existieren verschiedene Varianten. So kann z. B. zwischen verschiedenen Selektionsmarkern gewählt werden, und es stehen für verschiedene Anwendungen (beziehungsweise Pflanzenspezies) Cas9 Module mit unterschiedlichen regulatorischen Elementen (Promotoren) zur Verfügung. Die verschiedenen Kombinationen von Selektionsmarkern und Cas9 Varianten liegen bereits assembliert vor, zusammen mit einem Platzhalter anstelle des guide-RNA Moduls. Der Platzhalter kann für die individuellen Experimente durch eine oder aber bis zu acht guide-RNAs ersetzt werden. So lassen sich selbst Komplexe Konstrukte in nur wenigen Tagen ohne jegliche technische Hürden oder besondere Anforderungen erstellen. Wir führen diese Assembly-Reaktionen hier regelmäßig mit Studenten durch, welche in manchen Fällen keinerlei Erfahrungen mit solchen Arbeiten haben – mit fast 100 %iger Erfolgsquote. 
 
Einen großen Pluspunkt des Baukastensystems stellt die einfache Integration von bis zu acht guide-RNAs dar. Dies kann einerseits zur simultanen Modifikation verschiedener Orte im Genom verwendet werden, dem sogenannten multiplexing. So können mehrere Gene, welche z.B. ähnliche Funktionen besitzen, in einem Schritt ausgeschaltet werden. Andererseits kann das multiplexing zur Generierung größerer, chromosomaler Deletionen eingesetzt werden (Abb. 3). Zur Erzeugung solcher Deletionen wird die Cas9 Genschere durch mehrere guide-RNAs auf benachbarte Ziele im Genom programmiert. Werden beide Zielsequenzen geschnitten, so kann es bei der folgenden Reparatur zum Verlust des Fragments zwischen den beiden Doppelstrangbrüchen kommen. Wir haben unser Baukastensystem zur Generierung von Deletionen verschiedener Größe eingesetzt [5]. Zum einen wurde dabei festgestellt, dass chromosomale Deletionen, welche zwei Doppelstrangbrüche voraussetzen, weniger häufig auftreten, als durch einzelne Schnitte hervorgerufene Punktmutationen. Nichtsdestotrotz konnten kleine Deletionen (< 100 Basenpaare) mit relativ hohen Frequenzen erzeugt werden. Diese eignen sich hervorragend zur initialen Detektion der Mutation, sowie auch der Verfolgung der Mutation in weiteren genetischen Analysen. Des Weiteren wurden Deletionen mit einer Größe von bis zu 120.000 Basenpaaren – die bislang größte, durch Genome Editing stabil in Pflanzen generierte Deletion – erzeugt. Diese Ereignisse traten zwar mit eher geringer Frequenz auf (Abb. 3), erlaubten jedoch die Entfernung mehrerer homologer Gene in einem Schritt.
 
Fazit
 
Der Einsatz Cas9-basierter Nukleasen revolutioniert zurzeit die gezielte Modifikation des Genoms. Zur Programmierung wird einzig ein RNA-Molekül benötigt. Die unkomplizierte Programmierung in Kombination mit dem hier vorgestellten modularen Baukasten, welcher einem simplen, immer gleichen Schema in der Erstellung eines Konstrukts folgt und trotzdem Variabilität bewahrt, macht das Genome Editing in Pflanzen hochgradig anwendungsfreundlich, sodass es ohne weitere Einschränkungen als Standardtechnik eingesetzt werden kann.
 
Autoren
Jana Ordon1 und Johannes Stuttmann1

Zugehörigkeit
1 Martin-Luther-Universität Halle, Institut für Biologie / Genetik, Halle, Deutschland

 
Kontakt   
Martin-Luther-Universität Halle
Institut für Biologie / Genetik
Halle, Deutschland
johannes.stuttmann@genetik.uni-halle.de
 
 

Referenzen
1. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829.
2. Cong L, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819-23. doi: 10.1126/science.1231143.
3. Brouns SJ, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 2008;321(5891):960-4. doi: 10.1126/science.1159689.
4. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096. doi: 10.1126/science.1258096.
5. Ordon J, et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant J. 2017;89(1):155-68. doi: 10.1111/tpj.13319.

 
 

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