Beim Verlauf vieler Krankheiten spielen Glykoproteine eine entscheidende Rolle. Ihre strukturbiologische Charakterisierung gewinnt daher an Bedeutung. Die erste Hürde auf dem Weg zu einem dreidimensionalen Modell eines Glykoproteins ist seine rekombinante Herstellung. Neuartige Systeme zur Produktion glykosylierter Proteine basieren auf einer Kombination fluoreszierender Markerprotein und einer gezielten Integration von Transgenen an geeigneten chromosomalen Loci von Säugerzelllinien. Mit Hilfe des Rekombinase-vermittelten Kassettenaustauschs (RMCE) können Glykoproteine schnell und zuverlässig in Säugerzelllinien hergestellt werden. So wird es ermöglicht, auch anspruchsvolle Proteine in ausreichender Menge und hoher Qualität für die Kristallisation zu gewinnen.

Strukturbiologische und funktionale Daten von Proteinen mit pharmakologischer Bedeutung können die Medikamentenentwicklung entscheidend vorantreiben. Bei Infektionskrankheiten spielen Glykoproteine eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Abwehr von Pathogenen. Aber Glykoproteine werden von Pathogenen auch ausgenutzt, beispielsweise um in Körperzellen einzudringen (Abb. 1). Eine Grundvoraussetzung für strukturbiologische Studien ist die Verfügbarkeit des jeweiligen Proteins in ausreichender Menge und guter Qualität.

Die Produktion von rekombinanten Glykoproteinen stellt immer noch eine Herausforderung dar. Die korrekte Faltung dieser Proteine setzt eine richtige Glykosylierung und Bildung von Disulfidbrücken voraus. Rekombinante Säugerzelllinien stellen ein sehr leistungsfähiges, aber auch teures und aufwändiges Expressionssystem für Glykoproteine dar. Die konventionelle Etablierung geeigneter Zelllinien für die Proteinproduktion basiert auf der ungerichteten Integration eines Transgens in das Wirtszellgenom. Dabei sind wichtige Parameter für eine gute Produktionszelllinie, wie die Anzahl der Transgenkopien und der Integrationsort, nicht vorhersagbar. Hinzu kommt, dass die transgene DNA nur in sehr wenigen Zellen an einem der seltenen chromosomalen Loci eingebaut wird, die eine starke und dauerhafte Genaktivität ermöglichen. Um geeignete Produzenten zu finden, ist daher ein sehr aufwändiges Selektionsverfahren nötig [1].

Insbesondere für die Röntgenstrukturanalyse stellt die Heterogenität und Flexibilität der Zuckerketten, die von den Produktionszellen bei der Glykosylierung an das Protein gehängt werden, ein weiteres Problem dar.

So kann die Glykosylierung verhindern, dass für die Röntgenstrukturanalyse geeignete Kristalle gezüchtet werden können.

Mutierte Zelllinien wie CHO Lec3.2.8.1 produzieren Glykoproteine mit verkürzten Zuckerketten vom Mannose-reichen Typ [2]. Diese Glykoproteine können enzymatisch deglykosyliert und effizient kristallisiert werden [3]. Um zu gut kristallisierbaren Proteinen zu kommen, müssen oft viele unterschiedliche Varianten einer Proteinsequenz getestet werden. Daher ist ein schnelles und flexibles Expressionssystem gerade für die Strukturbiologie von großem Interesse.

Gezielte Transgen-Integration durch Rekombination
Durch gezielte Manipulation des Wirtszellgenoms kann die ungerichtete Integration des Transgens vermieden und der Aufwand des Selektionsprozesses minimiert werden. Sequenz-spezifische Rekombinasen wie Cre oder Flp aus Saccharomyces cerevisiae erlauben es, Transgene gezielt an eine bestimmte Stelle des Genoms zu integrieren [4]. In embryonalen Stammzellen der Maus wird alternativ die homologe Rekombination sehr häufig angewandt, sie hat sich aber in differenzierten Zellen als ineffektiv herausgestellt.

Flp rekombiniert DNA-Moleküle, die die Flp-Erkennungssequenz FRT (Flp recognition target) enthalten. Der Rekombinase-vermittelte Kassettenaustausch (RMCE, recombinase-mediated cassette exchange) beruht auf synthetischen Varianten der natürlichen FRT-Sequenz. Die Flp-Rekombinase kann Moleküle mit derselben FRT-Variante rekombinieren lassen, aber eine Rekombination zwischen unterschiedlichen Varianten ist nicht möglich. Wenn DNA-Moleküle durch Flp rekombiniert werden, die Sequenzkassetten flankiert von unterschiedlichen FRTs enthalten, werden diese Kassetten gegeneinander ausgetauscht (Abb. 2).

Um Produktionszelllinien mit RMCE zu entwickeln, haben wir zunächst einen geeigneten chromosomalen Lokus der CHO Lec3.2.8.1 Wirtszellen markiert. Dazu wurde an einem chromosomalen Lokus, der eine besonders starke und dauerhafte Genaktivtät erlaubt, eine Kassette mit einer FRT-flankierten DNA-Sequenz integriert [3]. Danach wurden die eigentlichen Produktionszelllinien durch Austausch der integrierten Kassette gegen die Gene der zu produzierenden Glykoproteine gewonnen (Abb. 2).

Um zunächst einen geeigneten chromosomalen Lokus zu markieren, verwendeten wir ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) als Marker. Zellen, die das GFP-Gen zufällig an einem geeigneten chromosomalen Locus integriert hatten, wurden durch Durchflusszytometrie (FACS) isoliert. Daraus resultierten RMCE-Masterzelllinien, in denen nun die GFP-Kassette gegen andere Transgene ausgetauscht wurden (Abb. 2).
Die Masterzellen werden immer wieder verwendet, so dass neue Produktionszellen durch RMCE mit vergleichsweise geringem Aufwand in wenigen Wochen hergestellt werden können (Abb. 3). Da durch RMCE isogene, also genetisch identische Zellen generiert werden, entfällt das aufwändige Screening nach gut produzierenden Zelllinien. Stattdessen kann direkt nach dem RMCE mit der Produktion des sekretierten Glykoproteins begonnen werden.