Hochauflösende Einzelmolekülmikroskopie

Quantitative Bildgebung mit Nanometerauflösung

  • Abb. 1: Prinzip der Lokalisationsmikroskopie. Simulierter Datensatz mit einem antiken Mikroskop von Carl Zeiss als Beispielstruktur. Gleichzeitiges Emittieren aller Fluorophore ergibt ein konventionelles Fluoreszenzbild. Wird die Mehrzahl der Fluorophore in einen langlebigen, reversiblen Aus-Zustand gebracht und nur einige wenige zufällig aktiviert, kann deren Position mit Nanometerpräzision bestimmt werden. Mehrere tausend Einzelbildern werden verarbeitet und mit Hilfe aller Lokalisationen kann ein künstliches Bild rekonstruiert werden, dessen Auflösung von den Schalteigenschaften und den Helligkeiten der Fluorophore abhängt. Maßstab: 500 nm.
  • Abb. 2: a) Korrelative Lokalisations- und Elektronenmikroskopie. Links: das Membranprotein gp210 einer einzelnen Kernpore hochaufgelöst mit dSTORM, das typischerweise eine 8fach Symmetrie aufzeigt; Maßstab: 100 nm. Das hochaufgelöste dSTORM Bild von gp210 (Mitte) und das korrespondierende SEM (Scanning Electron Microscopy) Bild der nukleoplasmatischen Seite der Kernhülle (rechts) zeigen, dass Kernporenkomplexe hochspezifisch markiert werden können [6]; Maßstab 500 nm. b) Konventionelle Fluoreszenz- (links) und dSTORM Aufnahme (Mitte) von isolierten Herpes-simplex-Viren (HSV-1). Die Lokalisationen mehrerer Viruspartikel kann zur genauen Positionsbestimmung von Proteinschichten (VP16, rechts oben) gemittelt werden [7]. Maßstab: 500 nm.
  • Abb. 3: Links: dSTORM Aufnahme des präsynaptischen Proteins Bruchpilot (Brp) in neuromuskulären Synapsen von wildtypischen Drosophila Larven; links oben: konventionelle Fluoreszenzaufnahme. Rechts: Einzelne aktive Zonen des Wildtyps und der rab3rup Mutante. Die hochaufgelösten dSTORM Bilder zeigen, dass bei der Mutante die Verteilung der Brp-Moleküle innerhalb der aktiven Zone ungeordneter ist [9].  Maßstab: 2 µm (links), 500 nm (rechts).
  • Sebastian van de Linde war während seiner Promotion maßgeblich an der Entwicklung der Einzelmolekülmethode dSTROM beteiligt.

Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie (Super-Resolution Microscopy) kann nun die Auflösung um etwa eine Größenordnung verbessern, die bisher durch die Wellennatur des Lichts auf etwa 200 nm beschränkt waren und dadurch die kleinsten Strukturen nicht beobachtet werden konnten. Die höchste Auflösung erreicht derzeit die Lokalisationsmikroskopie, deren Einzelmolekülcharakter helfen kann, zelluläre Prozesse strukturell zu erklären.

Zellen - die kleinsten Organisationseinheiten des Lebens - blieben dem Menschen lange Zeit verborgen und konnten erst durch die Entwicklung der Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Verschiedene zelluläre Proteine können hochspezifisch mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen markiert und beobachtet werden. Obwohl die Auflösung der klassischen Fluoreszenzmikroskopie auf etwa 200 nm begrenzt ist, stellt sie ein bedeutendes Werkzeug in der biologischen und medizinischen Forschung dar.

In den letzten fünfzehn Jahren sind Methoden entwickelt worden, deren Auflösung um ein Vielfaches höher ist als jene klassischer Lichtmikroskope. Dazu gehören STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskopie, SIM (Structured Illumination Microscopy) und die Lokalisationsmikroskopie [1]. Für ihre Leistungen auf dem Gebiet der hochauflösenden Mikroskopie bzw. Einzelmolekülspektroskopie ist den Pionieren Eric Betzig, Stefan Hell und W. E. Moerner im vergangenen Jahr der Nobelpreis für Chemie 2014 verliehen worden.

Bei der Entwicklung sind Techniken zum Einsatz gekommen, die die von Ernst Abbe Ende des 19. Jahrhunderts postulierte, auf physikalische Gesetzmäßigkeiten beruhende Auflösungsgrenze umgehen konnten. Der Ansatz war nicht die schon ausgereizte Mikroskopie instrumentell weiter zu verbessern, sondern grundlegende Prinzipien der Photophysik und Photochemie der eingesetzten Fluorophore auszunutzen. Dies lässt sich besonders gut am Beispiel der Lokalisationsmikroskopie erklären, deren Prinzip und Anwendungspotential hier dargelegt wird.

Von der Detektion einzelner Moleküle zur hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie

W.

E. Moerner und Lothar Kador gelang es 1989 erstmals einzelne Moleküle zu detektieren [2]. Während in dieser ersten Arbeit die Einzelmoleküldetektion auf Absorption beruhte, wurde sie im darauffolgenden Jahr von drei Gruppen um Michel Orrit, Rudolf Rigler und Richard Keller mit Hilfe der Fluoreszenz einzelner Moleküle realisiert. Das Feld der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie war somit geboren.

Die Detektion der Fluoreszenz einzelner Moleküle ist heute, mehr als 20 Jahre später, die Grundlage der Lokalisationsmikroskopie. Sie besteht im Wesentlichen aus drei Elementen: Zunächst werden einzelne Moleküle mit Hilfe von lichtempfindlichen Kameras detektiert. Anschließend ermöglicht die Approximation eines mathematischen Modells an das beugungsbegrenzte Emissionsmuster des Moleküls die Bestimmung des Masseschwerpunkts. Diese Lokalisation ist umso genauer, je mehr Photonen detektiert werden, wobei in der Praxis eine Lokalisationspräzision von 20 nm und weniger erreicht werden kann. Schlussendlich wird aus den erhaltenen Koordinaten aller lokalisierten Moleküle ein hochaufgelöstes Bild rekonstruiert.

Dicht markierte Strukturen haben allerdings zur Folge, dass mehrere Fluorophore gleichzeitig fluoreszieren und somit keine isolierten Emissionsmuster einzelner Moleküle detektiert werden können. Der Durchbruch gelang durch die Entwicklung und den Einsatz von photoschaltbaren Fluorophoren. Diese besitzen einen fluoreszierenden An- und einen nichtfluoreszierenden Aus-Zustand und sind in der Lage, bei Bestrahlung mit Licht entsprechender Wellenlänge zwischen diesen Zuständen zu wechseln. Fluorophore dicht markierter Strukturen werden in der Lokalisationsmikroskopie somit nicht gleichzeitig sondern zu unterschiedlichen Zeitpunkten zufällig angeschaltet. Dabei werden einzelne, nicht überlappende Emissionsmuster detektiert und wie beschrieben lokalisiert (Abb. 1). Da ein Bild aus mehreren Millionen Lokalisationen bestehen kann, müssen Positionsbestimmung und Bildrekonstruktion automatisiert werden.

Zu den ersten Lokalisationsmethoden zählen PALM (Photoactivated Localization Microscopy) [3] und STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) [4], die 2006 vorgestellt wurden. Während in PALM photoaktivierbare fluoreszierende Proteine (FPs) als Photoschalter eingesetzt werden, benutzt STORM spezielle Farbstoffpaare. Eine Weiterentwicklung stellt die Methode dSTORM (direct STORM) dar, bei der konventionelle Farbstoffe direkt als Photoschalter genutzt werden können, z.B. kommerziell erhältliche farbstoffmarkierte Antikörper [5]. Während photoaktivierbare FPs photochemisch allein durch die Bestrahlung von Laserlicht geschaltet werden, bedarf der Einsatz organischer Farbstoffmoleküle in dSTORM der Zugabe von chemischen Puffern. Noch heute werden verbesserte photoschaltbare Fluorophore entwickelt, entweder durch Mutagenese und Screening von FPs oder durch ein verbessertes Verständnis der Photophysik organischer Farbstoffmoleküle.

Korrelation mit Elektronenmikroskopie

Das Ergebnis der Lokalisationsmikroskopie stellt keineswegs direkt ein hochaufgelöstes Bild dar, sondern eine Liste mit Molekülpositionen, die in Abhängigkeit von der Anzahl der detektierten Photonen nanometergenau bestimmt wurden. Diese Koordinaten können in ein artifizielles Bild übersetzt werden, z. B. als zweidimensionales Histogramm. Aufgrund der hohen Lokalisationspräzision kann in dem künstlichen Bild die Pixelgröße sehr klein gewählt werden, typischerweise mit einer Kantenlänge von 10 nm. Das Bild ist ferner frei von Hintergrundfluoreszenz, die normalerweise die Qualität des Bildes verschlechtern würde, und enthält nur Signal in Form von Einzelmolekülpositionen, weshalb der Kontrast dieser Bilder sehr hoch sein kann.

Wie bei allen neuen Methoden muss geprüft werden, ob diese vertrauenswürdige Informationen liefern kann. Werden z.B. Zellen mit Antikörpern markiert, stellt sich immer die Frage, wie zugänglich die entsprechenden Epitope sind und wie spezifisch die Markierung insgesamt ist. Außerdem können, wenn die Markierungsdichte sehr hoch ist und die Schalteigenschaften der Fluorophore nicht ausreichend sind, Emissionsmuster mehrerer gleichzeitig leuchtender Fluorophore zu Fehllokalisationen führen. Übersteigt der Anteil an Fehllokalisationen eine gewisse Schwelle, verzerren Artefakte im rekonstruierten Bild die biologische Aussagekraft [5]. Abhilfe schafft die Korrelation von lokalisationsmikroskopischen Daten mit bereits etablierten Methoden wie die der Elektronenmikroskopie. Diese Kontrollmessungen sind bereits in der ersten Arbeit zu PALM durchgeführt worden [2]. Weiterhin konnte mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Aufnahmen isolierter Kernhüllen des Krallenfroschs Xenopus laevis demonstriert werden, dass mittels dSTORM der Kernporenkomplex zuverlässig markiert und hochaufgelöst werden kann (Abb. 2a) [6].

Hohe Präzision durch Mittelung

Werden biologische Strukturen untersucht, hängt die Qualität der hochaufgelösten Rekonstruktion stark von der Markierungsdichte ab. Bei der Immunfluoreszenz kann die Epitopzugänglichkeit eingeschränkt sein, weshalb Strukturen unvollständig markiert werden und schlecht aufgelöst sein können. Strukturen, die innerhalb der Probe wiederholt vorkommen, können allerdings zu einer vollständigen Struktur gemittelt werden (Abb. 2b). Dieses Verfahren stammt ursprünglich aus der Elektronenmikroskopie und wurde in der Lokalisationsmikroskopie erstmals an Kernporen, die in hoher Dichte in der Kernhülle vorkommen, erprobt. Da die gemittelte finale Struktur aus den Einzelmolekülkoordinaten aller verwendeter Partikel besteht, kann deren Geometrie mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Auf diese Weise wurden vier verschiedene Proteine in Herpes Viren untersucht, deren radiale Anordnung zwischen Virenhülle und Kapsid bestimmt worden ist [7].

Quantitative Information

Da präzise Molekülpositionen das direkte Resultat der Lokalisationsmikroskopie sind, können absolute Molekülzahlen in Zellen, Zellorganellen und Zellkompartimenten bestimmt werden [8, 9]. Dieser quantitative Charakter der Lokalisationsmikroskopie ist von entscheidender Bedeutung, um zelluläre Prozesse auf Grundlage von Molekülzahlen verstehen zu können. Allerdings wird die Quantifizierung durch mehrere Umstände erschwert. Neben unvollständiger Markierung können Fluorophore während der Aufnahme mehrfach an- und ausgeschaltet werden. Organische Farbstoffmoleküle sorgen so für mehrere Lokalisationen und auch photoaktivierbare FPs, deren Übergang vom Aus- in den An-Zustand idealerweise irreversibler Natur sein sollte, können in der Fluoreszenzemission fluktuieren (Photoblinken) und so mehrfach lokalisiert werden.

Daher ist es notwendig Referenzmessungen durchzuführen, um die durchschnittliche Anzahl der Lokalisationen pro Fluorophor zu bestimmen. So konnte mit Hilfe von photoaktivierbaren FPs die Anzahl und Verteilung des Centromerproteins CENP-ACnp1 in Spalthefe charakterisiert werden [8]. Organische Farbstoffmoleküle kommen in der Regel an Antikörper gekoppelt zum Einsatz. Daher muss die Anzahl der Lokalisationen pro markiertem Epitop, an das ein Primär- und an diesem wiederum mehrere Sekundärantikörper binden, über Titrationsexperimente bestimmt werden [9].

Anwendungen in der Neurobiologie

Die Leistungsfähigkeit des menschlichen Gehirns basiert auf komplexen Interaktionen von Nervenzellen. Wie genau die Signalübertagung an Synapsen, den Grenzflächen zweier Zellen, molekular organisiert ist, ist nur unzureichend verstanden. Mit Neurotransmitter gefüllte Vesikel fusionieren in der präsynaptischen aktiven Zone bei Vorhandensein eines Aktionspotentials, wodurch Neurotransmitter in den synaptischen Spalt entleert werden. Das Binden dieser Botenstoffe an Rezeptoren der Postsynapse markiert den Endpunkt der Signalübertragung.

dSTORM wurde eingesetzt, um die molekulare Organisation von „Bruchpilot" (Brp), ein präsynaptisches Protein der aktiven Zone, in Drosophila Larven zu untersuchen (Abb. 3) [9]. Mit Hilfe von dSTORM konnte die Struktur der Brp-Verteilung mit hoher räumlicher Auflösung dargestellt werden. Darüber hinaus wurde die Anzahl der Brp-Moleküle in wildtypischen und mutierten Drosophila Larven quantitativ bestimmt und mit elektrophysiologischen Messungen korreliert, um Struktur-Funktionszusammenhänge aufzuklären. So konnte die gegenüber dem Wildtyp elektrophysiologisch veränderte synaptische Aktivität der Mutante rab3rup mit einer erhöhten Brp-Anzahl und einer strukturell ungeordneteren Brp-Verteilung in der aktiven Zonen erklärt werden.

Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie stellt insgesamt ein wichtiges Hilfsmittel dar, um eine der großen Herausforderungen des 21. Jahrhunderts anzugehen: die dem Gehirn zugrundeliegenden Funktionsmechanismen zu entschlüsseln, um z. B. neurodegenerative Krankheiten verstehen zu können.

Zusammenfassung

Mit der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie hat eine neue Mikroskopie-Ära begonnen. Forschern stehen nun Möglichkeiten zur Verfügung, zelluläre Strukturen mit bisher nicht dagewesener hoher räumlicher Auflösung zu untersuchen. Die Lokalisationsmikroskopie findet bereits breite Anwendung in der biologischen und medizinischen Forschung und wird auch in Kombination mit anderen Mikroskopieansätzen wie der Lichtblattmikroskopie eingesetzt [10]. Wir stehen erst am Beginn, das volle Potential der Methode auszuschöpfen.

Literatur
[1] Hell, S. W.: Nat. Methods 6, 24-32 (2009)
[2] Moerner W. E. und Kador L.: Phys. Rev. Lett. 62, 2535-2538 (1989)
[3] Betzig E. et al.: Science 313, 1642-1645 (2006)
[4] Rust M. J. et al.: Nat. Methods 3, 793-795 (2006)
[5] van de Linde S. et al.: Nat. Protoc. 6, 991-1009 (2011)
[6] Löschberger A. et al.: J. Cell Sci. 127, 4351-4355 (2014)
[7] Laine R. F. et al.: Nat. Commun. 6, 5980 (2015)
[8] Lando D. et al.: Open Biol. 2, 120078 (2012)
[9] Ehmann N. et al.: Nat. Commun. 5, 4650 (2014)
[10] Chen B. C. et al.: Science 346, 1257998 (2014)

Lebenslauf
Sebastian van de Linde
ist Nachwuchsgruppenleiter am Lehrstuhl für Biotechnologie und Biophysik der Universität Würzburg. Er war während seiner Promotion maßgeblich an der Entwicklung der Einzelmolekülmethode dSTROM beteiligt. Gegenwärtig forscht er an der Weiterentwicklung der Lokalisationsmikroskopie und deren quantitativen Anwendung auf zellulärer Ebene.

Kontakt
Dr. Sebastian van de Linde

Department of Biotechnology & Biophysics
Julius-Maximilians-University
Würzburg, Germany

Kontaktieren

Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Am Hubland
97074 Würzburg
Deutschland
Telefon: +49 931 31 80935
Telefax: +49 931 31 80935

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