Lab-on-a-Chip System: Sortierung von zirkulierenden Tumorzellen

  • Abb. 1: Der Soft Lithography Prozess zur Herstellung von Mikrokanälen.Abb. 1: Der Soft Lithography Prozess zur Herstellung von Mikrokanälen.
  • Abb. 1: Der Soft Lithography Prozess zur Herstellung von Mikrokanälen.
  • Abb. 2: NILICS Versuchsaufbau und Trennung von MV3- Melanomzellen [8].
  • Abb. 3: Mikroskopaufnahmen des Sortiervorgangs an verschiedenen Positionen im Kanal und Sortiereffizienz in Abhängigkeit von Flussrate Q und Hämatokrit [8].
  • Tab. 1: Sortiereffizienz des NILICS-Aufbaus für MV3-Zellen bei verschiedenen Fokussierflussraten und Hämatokritwerten.
  • Schematische Darstellung der Zelltrennung am Ende des Kanals. Illustration: Christoph Hohmann, Nanosystems Initiative Munich (NIM)

Lab-on-a-chip: Die Sortierung von Zellen entsprechend ihrer Eigenschaften ist von grundlegender Bedeutung für Anwendungen in Forschung und Medizin. Durch das schnell wachsende Feld der Mikrofluidik eröffnen sich neue Möglichkeiten, diese Herausforderung zu meistern. Mit non-inertial lift induced cell sorting (NILICS) gelingt es, auf einem nur wenige Millimeter großen Chip, zirkulierende Tumorzellen hocheffizient von umgebenden Blutzellen zu trennen.

Bedarf an verbesserter Diagnostik
Etwa 14 Millionen Neuerkrankungen und über 8 Millionen Todesfälle weltweit im Jahr 2012 - im Welt-Krebs-Bericht 2014 der Weltgesundheitsorganisation (WHO) werden die Ausmaße der vielschichtigen Krankheit deutlich, die sich über die nächsten 20 Jahre noch weiter verschlimmern werden [1]. Ein wichtiger Ansatzpunkt, um die Überlebenschancen von Patienten zu erhöhen, ist eine frühzeitige Diagnose der Krankheit. Zudem können auf diesem Weg enorme Behandlungskosten eingespart werden. Problematisch hierbei ist, dass über 60 % der weltweit Erkrankten in Afrika, Asien, Zentral- oder Südamerika leben, also Ländern, in denen eine flächendeckende medizinische Versorgung nicht gewährleistet werden kann. Um dennoch eine hinreichende medizinische Versorgung in strukturschwachen Gebieten der Erde zu gewährleisten, muss die Entwicklung effektiver und kostengünstiger Diagnosemöglichkeiten vorangetrieben werden.

Einen vielversprechenden Ansatz hierzu bieten sogenannte Lab-on-a-Chip Systeme (LOC). Dabei werden, ähnlich der Entwicklung von Mikroprozessoren in der Elektrotechnik, Laborprozesse miniaturisiert und in einen nur wenige Millimeter großen Chip integriert. Solch winzige Chips sind günstig herstellbar, einfach lager- und transportierbar und benötigen darüber hinaus nur geringste Mengen an Proben und Reagenzien. Zudem lassen Sie sich leicht parallelisieren und automatisieren [2]. Mit LOC Systemen können aber nicht nur Kosten für Personal und Laborausstattung eingespart werden, auch die Empfindlichkeit der Bauteile ist deutlich höher, sodass die erzielten Ergebnisse präziser und die Analysezeiten dramatisch kürzer als bei herkömmlichen Methoden sind.

Dies hat enorme Auswirkungen auf die Behandlung von Patienten, denn die Laborergebnisse stehen praktisch sofort nach der Untersuchung zur Verfügung und müssen nicht erst zur Auswertung in Speziallabors geschickt werden.

Miniaturisierung durch Mikrofluidik
Um solch kleine Labore zu ermöglichen, müssen sämtliche Prozesse und Vorgänge miniaturisiert werden. Dabei ändern sich jedoch die relevanten physikalischen Gesetze und man hat mit ganz neuartigen technischen Herausforderungen zu tun. Die physikalische Disziplin, die sich mit dem Verhalten von Flüssigkeiten und Partikeln wie z. B. Zellen und Bakterien auf der Größenskala von Mikrometern beschäftigt, ist die Mikrofluidik [3]. Um ein Maß dafür zu haben, welche physikalischen Phänomene im jeweiligen System in Betracht gezogen werden müssen, werden in der Mikrofluidik dimensionslose Zahlen eingeführt [4]. Der bekannteste Vertreter dieser Maßzahlen ist die Reynoldszahl Re. Sie beschreibt das Verhältnis zwischen Trägheitseffekten und solchen, die durch die zähen, viskosen Eigenschaften des Mediums hervorgerufen werden durch

mit der Dichte der Flüssigkeit ρ, deren Viskosität μ und charakteristischen Geschwindigkeit v sowie der charakteristischen Kanalgröße D. Unsere alltäglichen Erfahrungen spielen sich typischerweise bei hohen Re ab. Das heißt, dass z. B. in Flüssen durch die Trägheit des Wassers Turbulenzen hervorgerufen werden, die zu Wirbeln führen. Bei kleinen Re spielt die Trägheit hingegen keine Rolle. Es bilden sich turbulenzfreie, sogenannte laminare Strömungen aus, in denen sich Flüssigkeitsschichten ohne Verwirbelungen nebeneinander her bewegen. Dabei entsteht in geschlossenen Kanälen ein parabolisch geformtes Geschwindigkeitsprofil: die Flüssigkeitsschicht direkt an der Wand wird von dieser durch Reibung am stärksten gebremst, die nächste Schicht etwas weniger, wodurch sie etwas schneller fließt, bis in die Mitte des Kanals, wo die Flussgeschwindigkeit schließlich am höchsten ist. Ein Maß für die Änderung der Flussgeschwindigkeit quer zur Kanalstömung (in z-Richtung) ist die Scherrate γ· = dv/dz. Sie ist nahe der Wand am höchsten und nimmt zur Kanalmitte bis auf Null ab.

Herstellung durch Soft Lithography
Während kleinste Kanäle mit Durchmessern im Mikrometerbereich früher nur durch Erwärmen und Ausziehen von Glaskapillaren hergestellt werden konnten, entwickelte sich um die Jahrtausendwende herum die Technik der Soft Lithography [5]. Sie ermöglicht die schnelle und kostengünstige Entwicklung von Mikrokanälen unterschiedlichster Geometrien (Rapid Prototyping). Der in Abb. 1 illustrierte Herstellungsprozess beginnt am Computer mit dem Entwurf des Kanals in Form einer Vektorgrafik. Die auf einer Spezialfolie gedruckte Maske wird dann im Reinraum dazu verwendet, um einen mit Fotolack beschichteten Silizium Wafer selektiv zu belichten. Nach der Entwicklung bleiben nur die belichteten Strukturen stehen und bilden den „Kanalstempel“. Der Stempel wird mit flüssigem Polydimethylsiloxan (PDMS) abgegossen, welches zu einem gummiartigen Material erstarrt und anschließend abgezogen werden kann. Nachdem die Zugänge für die Schläuche gestanzt und die PDMS- und Objektträgeroberflächen mit einem Sauerstoffplasma aktiviert wurden, kann der Kanal fest mit dem Glasobjektträger verbunden werden.

NILICS: Trennung im Fluss
Bereits in der Mitte des 19. Jahrhunderts ist beobachtet worden, dass rote Blutkörperchen (RBK) in kleinen Kapillaren zur Kanalmitte migrieren. Physikalischer Grund für die Migration von deformierbaren Objekten im laminaren Fluss bei Re < 1 ist eine abstoßende Wechselwirkung zwischen Objekt und Wand, genannt „non-inertial lift“ [6]. Der non-inertial lift wird durch einen Symmetriebruch im laminaren Fluss ermöglicht. Dieser entsteht durch die Störung des Flussfeldes durch das Objekt und dessen Wechselspiel mit der Wand entsteht. Bei Re < 1 bedingt die Deformierbarkeit des Objektes den notwendigen Symmetriebruch, was beispielsweise zur Folge hat, dass nicht deformierbare Kugeln keine Liftkraft erfahren.

Die Stärke des Effektes auf Objekte wie z. B. Zellen kann aus einer theoretischen Betrachtung der Liftgeschwindigkeit abgeleitet werden [7]. Danach migriert eine Zelle mit der Liftgeschwindigkeit vl

quer zum Fluss von der Wand weg, mit dem effektiven Zellradius R, dem Abstand der Zelle zur Wand z und der dimensionslosen Driftgeschwindigkeit U(λ,s1,s2), die vom Viskositätskontrast λ = ηin/ηout zwischen Zelle und Flüssigkeit und den Zell-Formparametern s1 und s2 abhängt. Die Formel zeigt, dass ein Objekt umso schneller migriert, je größer und deformierbarer es ist, und umso langsamer, je größer sein Abstand zur Wand und je kleiner die Scherrate.

Dieser Lifteffekt kann nun zur Sortierung von Zellen ausgenutzt werden (noninertial lift induced cell sorting, NILICS) [8]. In einem relativ einfachen mikrofluidischen Aufbau (Abb. 2) werden die Zellen in unterschiedlicher Konzentration (Hämatokrit, Hct) in eine Lösung aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Dextran gegeben. Die Probenlösung wird über eine Spritze in einen Kanal (Querschnitt: 60 x 60 μm, Länge: 20 mm) injiziert. Über eine zweite Spritze wird nun ein Fluss erzeugt, der die Zellen anfangs an die Wand des Kanals drückt (vgl. x1 in Abb. 2). Während sie den Kanal durchströmen migrieren die Zellen ihren Eigenschaften entsprechend unterschiedlich weit von der Kanalwand weg, bis sie an der Position x2 getrennte Höhenbereiche belegen. Die anschließende Verbreiterung des Kanals vergrößert die absoluten Abstände der Zellen voneinander (x3) und erleichtert die Sortierung in separate Höhenreservoire.

Sortierung von CTCs
Nach einer ausführlichen Charakterisierung des Systems konnte es erfolgreich zur Sortierung von RBK und Blutplättchen eingesetzt werden [9]. Weitere Untersuchungen wurden anhand zirkulierenden Tumorzellen (circulating tumor cells, CTC) und RBK-Lösungen durchgeführt [8]. CTCs sind in der medizinischen Forschung von besonderem Interesse, da sie Diagnosemöglichkeiten bieten, die ohne Biopsie des Primärtumors auskommen. Allerdings kommen lediglich 1-100 CTCs auf ca. 6 Mio. körpereigene Blutzellen, weshalb sie für weitere Untersuchungen erst aus diesen aussortiert werden müssen. Um dies zu erreichen wurden Vollblutproben verdünnt (Hct = 1 %, 4 % und 9 %) und mit MV3-Melanomzellen aus einer Zellkultur versetzt. Die Probenlösung wurde in den NILICS-Kanal injiziert und die Trennung mit einer Hochgeschwindigkeitskamera überwacht. Da sie größer sind als RBK, befinden sich CTCs am Ende des Kanals entsprechend weiter weg von der Wand (vgl. Abb. 3) und können daher aus der RBK-Lösung aussortiert werden. Bei niedrigen Hämatokritwerten konnte eine durchweg hohe Sortiereffizienz (Anzahl richtig sortierte CTCs / Anzahl alle CTCs) und Reinheit (Anzahl CTCs / Anzahl RBK in der gesammelten Probe) erreicht werden. Wie in Abbildung 3 und Tabelle 1 zu erkennen, wurden diese Kenngrößen bei konstanter Flussrate mit steigendem Hämatokrit etwas schlechter. Grund hierfür sind Zell-Zell-Wechselwirkungen, die durch die vergrößerte Zellanzahl stärker zum Tragen kommen. Die höhere Zahl der RBK führt zu vermehrten Stößen zwischen den CTCs und den RBK, weshalb die CTCs in ihrer Migration behindert werden und schließlich nicht so hoch steigen können bzw. einige RBK nach oben ablenkten. Dem konnte allerdings durch eine Erhöhung des Fokussierflusses entgegengewirkt werden. Die stärkere Fokussierung der Zellen am Kanaleingang hat zur Folge, dass der Schwerpunkt der RBK bereits dort unterhalb der CTCs liegt und sich die Trajektorien der Zellen seltener kreuzen. Dies bestätigen die durchweg guten Werte der Sortiereffizienz bei höheren Flussraten und die hervorragende Sortiereffiz ienz von 100% bei Hct = 9 %. Die aussortierten Zellen bleiben unbeschädigt und können wieder in Kultur übernommen werden.

Zusammenfassung
Die vorgestellte Methode besticht durch den Verzicht auf Zellmarkierungen, die bisher notwendig waren, und die im Vergleich zu konventionellen Methoden hohe Sortiereffizienz. Durch den einfachen Aufbau, die Möglichkeit der kostengünstigen Massenproduktion und der Vollautomatisierung des Tests, könnte NILICS einen Ansatzpunkt für routinemäßige Kontrollen bereits beim Hausarzt darstellen. Nächstes Ziel muss eine weitere Verbesserung der Methode hinsichtlich des verwendbaren Hämatokrits sowie der direkte Test mit Patientenproben sein, um die vielversprechende Methode auf ihre Tauglichkeit im klinischen Alltag zu überprüfen.

Die Forschungsarbeiten wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG 1253 und dem Bundesministerium BMBF via FROPT unterstützt.

Titelbild mit freundlicher Unterstützung von Christoph Hohmann (Nanosystems Initiative Munich, NIM).

Literatur
[1] WHO/IARC, “IARC Press Release No. 224,” 2014. [Online]. Available: http://www.iarc.fr/ en/media-centre/pr/2014/pdfs/pr224_E.pdf. [Accessed: 14-Feb-2014].
[2] Franke T. and Wixforth A.: Chemphyschem, vol. 9, no. 15, pp. 2140–56, Oct. (2008)
[3] Stone H. A. und Kim, S.: AIChE J., vol. 47, no. 6, pp. 1250–1254, (2001)
[4] Squires T. and Quake S.: Microfluidics: Rev. Mod. Phys., vol. 77, no. 3, pp. 977–1026, Oct. (2005)
[5] Xia Y. und Whitesides G. M.: Annu. Rev. Mater. Sci., vol. 28, no. 1, pp. 153–184, Aug. (1998)
[6] Geislinger T. M. Adv. Colloid Interface Sci., accepted.
[7] Olla P.: Journale Phys. II, vol. 10, pp. 1533– 1540 (1997)
[8] Geislinger T. M. und Franke T.: Biomicrofluidics, vol. 7, no. 4, p. 44120, Jan. (2013)
[9] Geislinger T. M. et al.: Appl. Phys. Lett., vol. 100, no. 18, p. 183701 (2012)

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/Mikrofluidik
Mehr Informationen zum Thema Lab-on-a-Chip: http://bit.ly/GIT-LOC

Autor(en)

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University of Glasgow
School of Physics and Astronomy
G12 8QQ Glasgow
United Kingdom

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