Molekulare Kraftklammer: Kraftspektroskopie leicht gemacht

  • Molekulare Kraftklammer: Kraftspektroskopie leicht gemachtMolekulare Kraftklammer: Kraftspektroskopie leicht gemacht
  • Molekulare Kraftklammer: Kraftspektroskopie leicht gemacht
  • Abb. 1: Schematische Darstellung der Kraftspektroskopie mit einem Rasterkraftmikroskop (A) und einer molekularen DNA Origami Kraftklammer (B). Bei der AFM Spektroskopie wird die Kraft, die auf die Messsonde wirkt, in Abhängigkeit der Position der Messsonde aufgetragen (C), während bei der molekularen Kraftklammer die FRET Effizienz ausgelesen und gegen die angelegte Kraft aufgetragen wird (D).
  • Abb. 2: A) TEM-Aufnahmen der 6 pN Version der molekularen Kraftklammer. B) Beispielhaft gewählte Aufnahmen der molekularen Kraftklammer bei 0 pN, 6 pN und 12 pN. Die einzelsträngige DNA ist durch das TEM in diesem Fall nicht abbildbar. C-E) Untersuchung der Kraftabhängigkeit der Holliday Junction (HJ). C) Die HJ wird in der Kraftklammer eingespannt und die Konformationsänderung beobachtet. D) Die gemessenen FRET-Werte bei unterschiedlichen Kräften werden histogrammiert und der Erwartungswert mit einer Gauß-Funktion ermittelt. E) Auftragung der ermittelten Übergangsraten bei unterschiedlichen Kräften. Untersuchung der Kraftabhängigkeit des TATA-Box bindenden Proteins (TBP) unter Verwendung der nanoskopischen Kraftklammer. F-H) Untersuchung der Kraftabhängigkeit des TATA-Box bindenden Proteins (TBP). F) In der Kraftklammer wird die TATA-Box implementiert, an die das TBP anbinden kann und die Farbstoffe zu beiden Seiten der TATA-Box angebracht. Bindet TBP an die TATABox, verkürzt sich der Abstand zwischen den Farbstoffen. G) Histogramme über alle gemessenen FRET-Werte bei unterschiedlichen Kräften. H) Auftragung der ermittelten Wahrscheinlichkeit des geknickten Zustands bei unterschiedlichen Kräften [4].
Bettina Wünsch1, Philipp Nickels2, Tim Schröder1, Dina Grohmann3, Tim Liedl2, Philip Tinnefeld1
 
Zellen und komplexere biologische Systeme wie Gewebe und Lebewesen sind unentwegt mechanischen Kräften ausgesetzt, spüren diese und reagieren adäquat zum Beispiel durch Anpassen der Struktur, der Rigidität, durch Bewegung oder durch Ausbilden starrer Strukturen wie beispielsweise von Filamenten. Die Mechanismen der mechanischen Stabilität und der mechanischen Sensorik auf molekularer Ebene sind ein aktuelles Forschungsgebiet der Biophysik, das ausgeklügelte Experimente auf der Ebene einzelner molekularer Interaktionen hervorgebracht hat.
 
Motivation
 
Bisher basieren Kraftexperimente darauf, dass  einzelne Moleküle zwischen eine Oberfläche und eine höchstempfindliche Feder wie der eines Rasterkraftmikroskops gespannt werden. 
In unserer Arbeit präsentieren wir einen neuartigen Ansatz zur Kraftspektroskopie, der auf autonomen, selbstassemblierten Kraftklammern beruht, die mit Hilfe der DNA Nanotechnologie hergestellt werden. In einem robusten und starren „DNA-Rahmen“, der nur wenige Nanometer groß ist, werden mit Hilfe von einzelsträngiger DNA Kräfte auf eingespannte Strukturen ausgeübt. Die neue Methode vermeidet die störungsanfällige Verknüpfung zur makroskopischen Welt und erlaubt aufgrund der Parallelisierung schnellere und einfachere Messungen in einem Kraftbereich, der sonst nur mit äußerst großem Aufwand zugänglich ist.
 
Herkömmliche Techniken
 
Bislang wurde für die Erforschung von Kräften einzelner Moleküle die Rasterkraft-Mikroskopie (AFM, atomic force microscopy), sowie die optische oder magnetische Pinzette verwendet. Beim AFM wird ein Molekül zwischen der Substratoberfläche und der Messsonde durch chemische Bindungen eingespannt. Wird die Messsonde von der Oberfläche weggezogen, kann die Auswirkung der Kraft auf das Molekül beobachtet werden (Abb. 1A). In einer so erhaltenen Kraft-Abstands-Kurve (Abb.

1C) können beispielsweise Faltungs-und Entfaltungsvorgänge von Proteinen [1] beobachtet werden. Der Nachteil dieser Methode ist, dass sie nur eindimensional wirkt und die zu untersuchenden Moleküle durch eine exakte Bewegung einer Messsonde, die eine Verbindung zur makroskopischen Welt hat, vermessen werden müssen. Obwohl mithilfe dieser Techniken bereits viele Interaktionen auf Einzelmolekülebene aufgeklärt werden konnten (Elastizität von DNA [1, 2]) sind diese Techniken sehr aufwändig und erlauben aufgrund ihrer zeitintensiven Arbeitsschritte  keine Hochdurchsatzmessungen. Jedes Molekül muss einzeln untersucht werden und der Austausch von Molekülen an der Messsonde ist aufwändig.

 
Neuer Ansatz
 
An dieser Stelle kommt unser neues System zum Tragen. Wir verwenden sogenannte DNA Origamis, um ein Design zu entwickeln, bei denen auf die Moleküle ohne äußeren Einfluss eine Kraft ausgeübt werden kann und gleichzeitig hunderte Moleküle auf ihr Kraftverhalten hin untersucht werden können.
Das erste sogenannte „DNA Origami“ wurde 2006 von Paul Rothemund [3] hergestellt. DNA Origamis bestehen aus einem langen DNA-Einzelstrang der durch Zugabe eines hohen Überschusses an kürzeren „Klammer-Strängen“ unterschiedlicher Sequenzen in eine zuvor berechnete Form gefaltet wird. Da dieser Vorgang selbstorganisiert ist, können Milliarden von Strukturen simultan in einem Experiment hergestellt werden.
Wir haben ein drei-dimensionales DNA Origami entwickelt, dass das Verhalten von Biomolekülen  unter unterschiedlichen Kräften untersuchen kann. Unser DNA Origami besteht aus einem festen Körper, der DNA Origami Kraftklammer, in deren Mitte eine einzelsträngige DNA Sequenz eingebettet ist (Abb. 1B und Abb. 2A und 2B für elektronenmikroskopische Aufnahmen der Kraftklammer). Die einzelsträngige DNA dient hier als Feder (entropische Feder) deren Federkonstante durch eine Variation ihrer Länge beliebig eingestellt werden kann. Das Molekül kann an die DNA Sequenz in der Mitte der Kraftklammer selbst anbinden oder angebunden werden. Auf diese Weise können beispielsweise Protein-DNA Interaktionen beobachtet werden sowie auch die Kräfte innerhalb eines Moleküls in einem Bereich von 0 bis 15 Piconewton, also genau den Kräften, die für Proteine und DNA relevant sind.
Um die Krafteinflüsse untersuchen zu können, wird der abstandsabhängige Förster-Resonanz-Energie Transfer auf Einzelmolekülebene ausgenutzt. Dafür werden zwei fluoreszierende Farbstoffe (Donor und Akzeptor) am Einzelstrang der DNA Origami Kraftklammer in einem bekannten Abstand gekoppelt. Liegen die beiden Farbstoffe dicht beieinander, kann Energie vom Donor-Farbstoff auf den Akzeptor-Farbstoff übertragen werden. Die Effizienz des Energie-Übertrags vom Donor- auf das Akzeptor-Molekül liegt zwischen 0 (kein Übertrag) und 1 (vollständiger Übertrag) und wird als FRET-Effizienz bezeichnet. Wird eine Kraft angelegt kann das zu untersuchende Molekül unter Umständen seine  Funktion nur noch eingeschränkt ausüben, was sich in einem veränderten Abstand (und FRET-Effizienz) der beiden Farbstoffe zueinander zeigt. In einem Diagramm wird dann die FRET-Effizienz bei unterschiedlichen Kräften dargestellt und daraus der Einfluss der Kraft auf die Moleküle ermittelt (Abb. 1D). Zur Demonstration der Zuverlässigkeit des Systems wurde zunächst die gut verstandene Holliday Junction (HJ) [5] auf ihre Kraftabhängigkeit hin untersucht. Die Holliday Junction ist eine kreuzförmige Verbindung von vier DNA-Einzelsträngen, die bei der Zellteilung (Meiose) auftritt. Sie kann bei Zugabe von Magnesiumionen zwischen zwei Konformationen wechseln (Abb. 2C). Werden zwei der vier Arme mit jeweils einem Farbstoffmolekül markiert kann durch die ständige Konformationsänderung ein Wechsel zwischen zwei FRET-Effizienzen aufgrund der Abstandsänderung beider Farbstoffe beobachtet werden. Für die Untersuchungen der Kraftabhängigkeit wird die HJ in die Kraftklammer eingespannt und die Veränderung der FRET-Effizienz über die Zeit gemessen und in einem Histogramm dargestellt (Abb. 2D). Werden Kräfte auf das System ausgeübt, verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen beiden Konformationen zu derjenigen, bei der die geringere Verspannung in der Struktur besteht, in unserem Fall also zu einem hohen FRET-Wert. Die extrahierten Übergangsraten bei unterschiedlichen Kräften [Abb. 2E) liefern bei einem Vergleich mit Messungen aus der Literatur [5] eine gute Übereinstimmung. 
Abgesehen von Untersuchungen der Biomoleküle selbst kann auch die Wechselwirkung zwischen DNA und Proteinen untersucht werden. Wir verwendeten den Transkriptionsfaktor mit Namen TATA-Box bindendes Protein, kurz: TBP. Dieses Protein bindet an doppelsträngige DNA in einem AT-reichen Sequenzbereich (TATA-Box) und knickt diese um etwa 90°. Wird der DNA Strang in der Mitte der Kraftklammer positioniert und zu beiden Seiten der TATA-Box ein Donor- bzw. ein Akzeptor-Farbstoff angebunden, so kann das An- und Abbinden des Proteins beobachtet werden, da mit diesem eine Abstandsänderung und somit eine Änderung des FRET-Wertes einhergeht (Abb. 2F). Ähnlich wie bei der HJ verschiebt sich auch hier das Verhältnis der beiden FRET-Werte durch Anlegen einer physiologisch relevanten Kraft von wenigen Piconewton (Abb. 2G). 
 
Zusammenfassung
 
Die selbst-faltende DNA Origami Kraftklammer ist ein neues System, das autonom Kräfte auf Biomoleküle ausüben kann und den Effekt auf dieses messen kann. Mit der Kraftklammer können Kräfte im Bereich von 0 bis  12 pN erzeugt werden, die aber auch bis auf circa 50 pN erweitert werden können. Durch die einfache Herstellung der Proben und die simultane Beobachtung hunderter Kraftklammern mit Standard-Einzelmolekülmikroskopie-Methoden wird die Kraftspektroskopie im Vergleich zu etablierten Methoden im nanoskopischen Bereich deutlich vereinfacht und könnte sogar auf lebende Zellen übertragen werden, da keine physische Verbindung zur makroskopischen Welt mehr nötig ist.
 
Zugehörigkeit
1TU Braunschweig, Institut für Physikalische und Theoretische Chemie, Braunschweig Integrated Center of Systems Biology (BRICS) und Laboratory for Emerging Nanometrology (LENA), Braunschweig
2Ludwig-Maximilians-Universität München, Fakultät für Physik und Center for NanoScience, München
3Universität Regensburg, Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie, Regensburg
Kontakt

Prof. Dr. Philip Tinnefeld
TU Braunschweig
Laboratory for Emerging Nanometrology (LENA)
Braunschweig
p.tinnefeld@tu-braunschweig.de

Mehr zum Thema: http://www.imaging-git.com/news/super-resolution-microscopy-nanorulers-made-dna

10 Jahre DNA Origami: https://www.youtube.com/watch?v=Trg2__Lgnc0

References

[1] Kellermayer, M.S.Z., Smith, S.B., Granzier, H.L., Bustamante, C. (1997) Folding-Unfolding Transitions in Single Titin Molecules Characterized with Laser Tweezers. Science, 276 (5315), 1112 . doi: 10.1126/science.276.5315.1112
[2] Smith, S.B., Cui, Y., Bustamante, C. (1996) Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science, 271 (5250), 795 . doi: 10.1126/science.271.5250.795
[3] Rothemund, P.W.K. (2006) Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature, 440 (7082), 297–302 . doi: 10.1038/nature04586
[4] Nickels, P.C., Wünsch, B., Holzmeister, P., Bae, W., Kneer, L.M., Grohmann, D., Tinnefeld, P., Liedl, T. (2016) Molecular force spectroscopy with a DNA origami–based nanoscopic force clamp. Science, 354 (6310), 305 . doi: 10.1126/science.aah5974
[5] Hohng, S., Zhou, R., Nahas, M.K., Yu, J., Schulten, K., Lilley, D.M.J., Ha, T. (2007) Fluorescence-Force Spectroscopy Maps Two-Dimensional Reaction Landscape of the Holliday Junction. Science, 318 (5848), 279 . doi: 10.1126/science.1146113

 

 

 

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