Molekulare Scheren revolutionieren die Pflanzen-Züchtung

Das CRISPR/Cas System

  • Abb. 1: Programmierbare Cas9-vermittelte Induktion von DSBs und deren Reparatur. (A) Ein 20nt langer Abschnitt der gRNA bestimmt, an welcher Stelle im Genom Cas9 bindet und einen DSB induziert. Da diese Zielsequenz spezifisch über RNA-DNA Basenpaarungen determiniert wird, kann Cas9 für beliebige Ziele im Genom programmiert werden. Der induzierte DSB wird über zelleigene Mechanismen beseitigt: die konservative HR führt durch das Kopieren identischer Sequenzen aus ektopischen Bereichen des Genoms, dem homologen Chromosom oder dem Schwesterchromatid zur Reparatur. Der vorherrschende Mechanismus in höheren Eukaryoten ist jedoch das Verknüpfen der Bruchenden durch NHEJ, wodurch es oft zu kleinen Insertionen oder Deletionen kommt.Abb. 1: Programmierbare Cas9-vermittelte Induktion von DSBs und deren Reparatur. (A) Ein 20nt langer Abschnitt der gRNA bestimmt, an welcher Stelle im Genom Cas9 bindet und einen DSB induziert. Da diese Zielsequenz spezifisch über RNA-DNA Basenpaarungen determiniert wird, kann Cas9 für beliebige Ziele im Genom programmiert werden. Der induzierte DSB wird über zelleigene Mechanismen beseitigt: die konservative HR führt durch das Kopieren identischer Sequenzen aus ektopischen Bereichen des Genoms, dem homologen Chromosom oder dem Schwesterchromatid zur Reparatur. Der vorherrschende Mechanismus in höheren Eukaryoten ist jedoch das Verknüpfen der Bruchenden durch NHEJ, wodurch es oft zu kleinen Insertionen oder Deletionen kommt.
  • Abb. 1: Programmierbare Cas9-vermittelte Induktion von DSBs und deren Reparatur. (A) Ein 20nt langer Abschnitt der gRNA bestimmt, an welcher Stelle im Genom Cas9 bindet und einen DSB induziert. Da diese Zielsequenz spezifisch über RNA-DNA Basenpaarungen determiniert wird, kann Cas9 für beliebige Ziele im Genom programmiert werden. Der induzierte DSB wird über zelleigene Mechanismen beseitigt: die konservative HR führt durch das Kopieren identischer Sequenzen aus ektopischen Bereichen des Genoms, dem homologen Chromosom oder dem Schwesterchromatid zur Reparatur. Der vorherrschende Mechanismus in höheren Eukaryoten ist jedoch das Verknüpfen der Bruchenden durch NHEJ, wodurch es oft zu kleinen Insertionen oder Deletionen kommt.
  • Abb. 1: Programmierbare Cas9-vermittelte Induktion von DSBs und deren Reparatur. (A) Ein 20nt langer Abschnitt der gRNA bestimmt, an welcher Stelle im Genom Cas9 bindet und einen DSB induziert. Da diese Zielsequenz spezifisch über RNA-DNA Basenpaarungen determiniert wird, kann Cas9 für beliebige Ziele im Genom programmiert werden. Der induzierte DSB wird über zelleigene Mechanismen beseitigt: die konservative HR führt durch das Kopieren identischer Sequenzen aus ektopischen Bereichen des Genoms, dem homologen Chromosom oder dem Schwesterchromatid zur Reparatur. Der vorherrschende Mechanismus in höheren Eukaryoten ist jedoch das Verknüpfen der Bruchenden durch NHEJ, wodurch es oft zu kleinen Insertionen oder Deletionen kommt.
  • Abb. 1: Programmierbare Cas9-vermittelte Induktion von DSBs und deren Reparatur. (B) Das zielgerichtete Einführen eines DSBs in das Pflanzengenom kann zur ortsspezifischen Mutagenese unter Verwendung des NHEJ-Reparaturweges verwendet werden (SDN-1). Alternativ können durch das zur DSB-Induktion gleichzeitige Anbieten einer linearen DNA-Sequenz mit Homologien zu den Bruchenden kleine (< 20nt, SDN-2) oder größere arteigene oder artfremde Sequenzabschnitte (SDN-3) mittels HR-vermittelter Reparatur in das Genom eingebaut werden (Gene Targeting) [5]. SDN: Site Directed Nuclease; Klassifikation.
  • Abb. 2: Genome Engineering. (A) Die Verwendung von inaktivierten Cas9-Orthologen (dCas9) mit verschiedenen Spezifitäten (gRNA A1-An, gRNA B1-Bn) und daran fusionierten Effektoren ermöglicht die gezielte Modulation der Genexpression.
  • Abb. 2: Genome Engineering. (B) Der Einsatz von Cas9-Orthologen mit unterschiedlichen Zielsequenzen ermöglicht das simultane Einbringen von DSBs an mehreren Loci. Auf diese Weise können Sequenz-Abschnitte (a) invertiert, (b) entfernt oder mobilisiert und reziproke Chromosomen-Translokationen (c1, c2) induziert werden. Damit lassen sich gezielt neue genetische Kopplungsgruppen erzeugen oder existierende aufbrechen und Limitationen der klassischen Pflanzenzüchtung überwinden. Arteigene Sequenzen können so zu neuen funktionalen Einheiten verbunden werden und damit das genetische Potenzial einer Spezies nutzen helfen.
Das in Bakterien gefundene CRISPR /Cas System revolutioniert die Möglichkeiten der gezielten Modifikation von Genomen und ermöglicht damit bahnbrechende Fortschritte bei der Pflanzenzüchtung. Das Verständnis der natürlichen Mechanismen zur Reparatur der DNA als Träger der Erbinformation in Kombination mit dem Einsatz dieses hochspezifischen, vielseitigen und effizienten molekularen Werkzeuges erlaubt das präzise Einführen von Mutationen in der DNA ebenso wie die gezielte Umstrukturierung von Genomen. 
 
Einleitung
 
Die DNA als Träger der genetischen Information ist ständig schädigenden Faktoren ausgesetzt. Daraus resultierende Veränderungen der DNA können Mutationen hervorrufen. Da die korrekte Weitergabe der Erbinformation an Nachkommen essentiell ist, haben sich im Laufe der Evolution spezifische Reparatur-Mechanismen entwickelt. Mutationen stellen jedoch auch ein Potenzial dar, durch kontinuierliche Veränderungen der Erbinformation dem Selektionsdruck unter sich ändernden Umweltbedingungen zu begegnen und bessere Eigenschaften hervorzubringen. Von solchen Überlegungen war der Mensch, als er vor mehr als 10.000 Jahren sesshaft wurde und anfing, Pflanzen zur Nahrungsgewinnung zu kultivieren, noch weit entfernt. Dennoch haben diese ersten Ackerbauern durch Auslese Pflanzen mit höheren Erträgen oder besseren Eigenschaften selektioniert und damit den Grundstein für die Pflanzenzüchtung gelegt. Später gewannen die Kreuzungs-Züchtung und unspezifische Mutagenese an Bedeutung darin, Genome von Nutzpflanzen zum Erhalt vorteilhafter Eigenschaften zu verändern. Die Menschheit steht heutzutage vor der Herausforderung, bei zunehmender Bevölkerungszahl und limitierten ackerbaulich nutzbaren Flächen die Nahrungsversorgung nachhaltig zu sichern. Daher sind neue Ansätze in der Pflanzenzüchtung erforderlich [1].
 
Das CRISPR / Cas System und seine Anwendung
 
Bisherige Methoden zur Ertragssteigerung und Entwicklung neuartiger Resistenzen basieren häufig auf der Anwendung von Mutagenen wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder ionisierender Strahlung zur Induktion ungerichteter Mutationen mit anschließender Selektion vorteilhafter Phänotypen.

Nachteilig bei diesen Verfahren ist, dass zum Erreichen einer zufallsbedingten nützlichen Eigenschaft neben der zeitaufwändigen Behandlung einer sehr großen Population von Individuen und dem damit verbundenen Screening zahllose unentdeckte Mutationen mit unbekannten Konsequenzen verursacht werden. Zwar können neuere Verfahren, welche auf Genomsequenzen und molekulare Marker zurückgreifen, Züchtungsverfahren beschleunigen, jedoch unterliegen auch sie Limitationen. Das CRISPR/Cas-System hat das Potenzial, diese zu überwinden und damit die Pflanzenzüchtung zu revolutionieren.

 
Bei CRISPR/Cas handelt es sich um ein bei vielen Bakterien und Archaeen vorkommendes adaptives Immunsystem. Verstanden wurde die Funktionsweise dieses Systems erst 2012 in den Arbeitsgruppen um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna. Sie konnten zeigen, dass Bakterien eindringende DNA von Bakteriophagen erkennen, in kleine 20 Nukleotide (nt) lange Stücke schneiden und in einen so genannten CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Locus im eigenen Genom integrieren. Dabei handelt es sich um eine Art Daten-Speicher für Fremd-DNA. Trifft ein Bakterium erneut auf einen Bakteriophagen mit derselben spezifischen Sequenz, kann die Cas9 Nuklease unter Verwendung dieser 20nt Erkennungssequenz (gRNA) die eindringende DNA als fremd erkennen und schneidet diese. Folglich kann der Bakteriophage das Bakterium nicht mehr infizieren. Charpentier und Doudna war schnell klar, dass sie mit ihrer Entdeckung ein bislang nie dagewesenes Werkzeug für die Molekularbiologie entdeckt hatten. Im Gegensatz zu bislang verwendeten molekularen Tools zum gezielten Schneiden der Erbinformation sind keine aufwändigen Vorarbeiten notwendig: Cas9 lässt sich durch eine frei wählbare gRNA für nahezu jedes Ziel in einem Genom programmieren. Die intrinsische Nuklease-Aktivität von Cas9 kann also zur gezielten Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) verwendet werden (Abb. 1A) [2]. 
 
DSBs werden von zelleigenen DNA-Reparaturmechanismen beseitigt. Die Kenntnis dieser Prozesse und der involvierten Faktoren erlaubt es, die Reparatur über Non-homologous End-joining (NHEJ) zur spezifischen Mutagenese zu verwenden oder die Homologe Rekombination (HR) zu begünstigen, um kontrolliert minimale Sequenzveränderungen oder größere arteigene oder artfremde Genabschnitte durch Gene Targeting einzufügen (Abb. 1B) [3]. So konnte z.B. durch das gezielte Ausschalten von Genen Mehltau-resistenter Weizen erzeugt werden [4]. Eine Modifikation an Cas9 erlaubt es, die Nuklease-Aktivität zu entfernen (dCas9) und über kurze Aminosäure-Linker Effektoren daran zu fusionieren, die an vordefinierten Stellen im Genom die Genexpression modulieren können (Abb. 2A). Da das CRISPR / Cas-System von Natur aus zum Erkennen mehrerer Zielsequenzen in der Lage ist, kann es auch biotechnologisch zum Multiplexing eingesetzt werden. Methodisch wird dies durch die Verwendung unterschiedlicher gRNAs bewerkstelligt, die alle von demselben Cas9 erkannt und verwendet werden können. Damit lassen sich mehrere DSBs gleichzeitig in einem Genom erzeugen und vorteilhafte genetische Kopplungen herstellen bzw. nachteilige aufheben (Abb. 2B). Mittlerweile wurden weitere CRISPR/Cas-Systeme aus verschiedenen Bakterienarten beschrieben. Diese Orthologe verwenden jeweils nur die arteigene gRNA [6]. Folglich lassen sich parallel zur DSB-Induktion an verschiedenen Positionen in einem Genom positive und negative Trans-kriptions-Effektoren anwenden. Damit ist neben einer maßgeschneiderten Modifikation von Genomen auch eine transiente oder permanente Beeinflussung des Transkriptoms möglich [7, 8]. 
 
Ausblick
 
Der biotechnologische Einsatz von Cas9 und seinen Orthologen erlaubt das gezielte Einführen eines oder mehrerer DSBs in das Pflanzengenom. Unter Verwendung 
pflanzeneigener DSB-Reparaturwege können damit präzise Mutationen oder Genom-Modifikationen erreicht werden. Die Vielseitigkeit des Systems erlaubt es zudem, Effektoren zur gezielten Modulation der Gen-Expression einzusetzen. Damit können der in der Natur vorhandene Genpool von Pflanzenspezies viel besser genutzt und durch bedarfsgerechte Regulation der Gen-Expression die Eigenschaften von Nutzpflanzen optimiert werden.
 
Autoren
Michael Pacher1 und Holger Puchta1
 
Zugehörigkeit
1Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Institut für Botanik, Molekularbiologie und Biochemie, Karlsruhe, Deutschland
 
Kontakt  
Prof. Dr. Holger Puchta
Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Botanisches Institut
Lehrstuhl Molekularbiologie und Biochemie
Holger.Puchta@kit.edu 

Referenzen

[1] Pacher M & Puchta H (2017) From classical mutagenesis to nuclease‐based breeding – directing natural DNA repair for a natural end‐product. Plant J DOI: 10.1111/tpj.13469
[2] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I et al (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337: 816–821
[3] Puchta H, Dujon B & Hohn B (1996) Two different but related mechanisms are used in plants for the repair of genomic double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA 93: 5055–5060
[4] Wang Y, Cheng X, Shan Q et al (2014) Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat Biotechnol 32: 947–951
[5] Fauser F, Roth N, Pacher M et al (2012) In planta gene targeting. Proc Natl Acad Sci USA 109: 7535–7540
[6] Schiml S & Puchta H (2016) Revolutionizing plant biology: multiple ways of genome engineering by CRISPR/Cas. Plant Methods 12: 8
[7] Steinert J, Schiml S, Fauser F & Puchta H (2015) Highly efficient heritable plant genome engineering using Cas9 orthologues from Streptococcus thermophilus and Staphylococcus aureus. Plant J 84:1295–1305
[8] Puchta H (2017): Applying CRISPR/Cas for genome engineering in plants: the best is yet to come. Curr Opin Plant Biol 36:1–8

 

 

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