Multiparameter-Durchflusszytometrie

Wie man die Komponenten des Immunsystems durchleuchten kann

  • Abb. 1: Octagon-Detektionssystem für den violetten (405 nm) Laser. Die durch den Laser erzeugten Lichtsignale werden durch ein Glasfaserkabel in das Octagonsystem geleitet und treffen zunächst auf einen 690 nm „Longpass“-Filter (690LP). Nur Licht einer Wellenlänge von ≥ 690 nm kann diesen Filter passieren und wird im Folgenden durch einen „Bandpass“-Filter weiter selektiert, in diesem Fall durch einen 710/50 Filter. Hierbei wird nur Licht im Wellenlängenbereich von 685 nm bis 735 nm hindurchgelassen und von Detektor A registriert. Lichtsignale mit einer kürzeren Wellenlänge als 690 nm werden bereits am „Longpass“-Filter gespiegelt und treffen auf eine weitere Kombination aus „Longpass“-Filter, „Bandpass“-Filter und Detektor. Abbildung adaptiert von: www.bdbiosciences.com.Abb. 1: Octagon-Detektionssystem für den violetten (405 nm) Laser. Die durch den Laser erzeugten Lichtsignale werden durch ein Glasfaserkabel in das Octagonsystem geleitet und treffen zunächst auf einen 690 nm „Longpass“-Filter (690LP). Nur Licht einer Wellenlänge von ≥ 690 nm kann diesen Filter passieren und wird im Folgenden durch einen „Bandpass“-Filter weiter selektiert, in diesem Fall durch einen 710/50 Filter. Hierbei wird nur Licht im Wellenlängenbereich von 685 nm bis 735 nm hindurchgelassen und von Detektor A registriert. Lichtsignale mit einer kürzeren Wellenlänge als 690 nm werden bereits am „Longpass“-Filter gespiegelt und treffen auf eine weitere Kombination aus „Longpass“-Filter, „Bandpass“-Filter und Detektor. Abbildung adaptiert von: www.bdbiosciences.com.
  • Abb. 1: Octagon-Detektionssystem für den violetten (405 nm) Laser. Die durch den Laser erzeugten Lichtsignale werden durch ein Glasfaserkabel in das Octagonsystem geleitet und treffen zunächst auf einen 690 nm „Longpass“-Filter (690LP). Nur Licht einer Wellenlänge von ≥ 690 nm kann diesen Filter passieren und wird im Folgenden durch einen „Bandpass“-Filter weiter selektiert, in diesem Fall durch einen 710/50 Filter. Hierbei wird nur Licht im Wellenlängenbereich von 685 nm bis 735 nm hindurchgelassen und von Detektor A registriert. Lichtsignale mit einer kürzeren Wellenlänge als 690 nm werden bereits am „Longpass“-Filter gespiegelt und treffen auf eine weitere Kombination aus „Longpass“-Filter, „Bandpass“-Filter und Detektor. Abbildung adaptiert von: www.bdbiosciences.com.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung verschiedener Emissionsspektren. Das LSRFortessa Durchflusszytometer verfügt über fünf Laser, drei Octagon- und zwei Trigon-Filteroptiken für die simultane Detektion von bis zu 18 Fluoreszenzsignalen und zwei morphologischen Parametern (Größe und Granularität). Exemplarisch dargestellt sind die Anregungswellenlängen der unterschiedlichen Laser, die zur Verfügung stehenden Fluorochrome, deren Emissionswellenlängen und die notwendigen Filtersysteme. Abbildung: http://www.bdbiosciences.com/in/research/multicolor/spectrum_viewer.
  • Abb. 3: „Wie man die Komponenten des Immunsystems durchleuchten kann“. Mithilfe eines Multiparameter-Durchflusszytometers ist es zum Beispiel möglich, unterschiedliche Zelltypen des Immunsystems parallel darzustellen und sie auf spannende Fragestellungen hin zu untersuchen. Eine mit den Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern „gefärbte“ Probe wird mit dem Durchflusszytometer vermessen, die entstandenen Lichtsignale durch die verschiedenen Detektoren gesammelt und schließlich als digitale Bildpunkte dargestellt. Eine sogenannte „Gating-Strategie“ hilft anschließend dabei, die für den Wissenschaftler wichtigen Informationen aus der Gesamtheit an Bildpunkten hervorzuheben. In dem gezeigten Beispiel werden die drei Untergruppen von Dendritischen Zellen im menschlichen Blut untersucht. Hierfür ist die Einbeziehung aller immunologischer Zellen mittels des Morphologie-Gates (SSC-A/FSC-A) notwendig. Im Weiteren werden nur einzelne (FSC-H/FSC-A) und lebende (Histogramm, DAPI negativ) Zellen in die Analyse einbezogen. Da die Untergruppen der Dendritischen Zellen in nur sehr geringer Zahl vorkommen, ist es ratsam, andere Zellen des Immunsystems aus der Analyse auszuschließen: B-Zellen (CD19/CD20 positiv), T-Zellen (CD3 positiv), NK-Zellen (CD56/NKp46 positiv) und Monozyten (CD14/CD11b positiv). Alle Dendritischen Zellen sind HLA-DR positiv und werden aufgrund Untergruppen-spezifischer Oberflächenproteine in plasmazytoide Dendritische Zellen (pDC: CD123 und CD303 positiv, blaues Kästchen), CD1c+ Dendritische Zellen (CD1c+ DC: CD11c und CD1c positiv, rotes Kästchen), und CD141+ Dendritische Zellen (CD141+ DC: CD11c und CD141 positiv, grünes Kästchen) unterteilt. Eine vergleichende Darstellung (Overlay-Histogramm, Abbildung unten rechts) zeigt deutlich, dass nur eine Untergruppe (CD141+ DCs, grün) das Protein Clec9A auf ihrer Oberfläche präsentiert. Zellparameter (FSC/SSC, Histogramm Y-Achsen) sind in linearer Skala und Fluoreszenzparameter in logarithmischer Skala dargestellt.
Gordon F. Heidkamp1, Lukas Heger1, Christian H. K. Lehmann1, Diana Dudziak1
 
Das menschliche Immunsystem ist einem tagtäglichen Kampf gegen eindringende Krankheitserreger und entartete Zellen ausgesetzt. Ein fein abgestimmtes Netzwerk an Zellen sorgt dafür, dass diese frühzeitig erkannt und vernichtet werden. In diesem Zusammenhang spricht man auch von den zwei Armen des Immunsystems: Das angeborene Immunsystem, zu dem unter anderem Monozyten, Makrophagen, Natürliche Killerzellen, Granulozyten und Dendritische Zellen gehören, und das „lernende“ (adaptive) Immunsystem der T- und B-Zellen. Letztere sind notwendig, um ein sogenanntes immunologisches Gedächtnis auszubilden, wodurch der Körper in der Lage ist, sich bei einer erneuten Infektion mit dem gleichen Erreger schneller und schlagkräftiger zur Wehr zu setzen.
 
Im Laufe der Zeit haben Wissenschaftler eine unglaubliche Vielzahl an Proteinen identifiziert, die für die Zellen des Immunsystems von großer und vielfältiger Bedeutung sind. Sie steuern zum Beispiel die zielgerichtete Bewegung und die Kommunikation der verschiedenen Zellen untereinander. Andere Proteine erkennen ganz spezifische Bestandteile bestimmter Krankheitserreger. Diese werden von den Zellen aufgenommen, zerkleinert und anschließend anderen Immunzellen präsentiert. Es hat sich gezeigt, dass die verschiedenen Zellen des Immunsystems durch spezifische Muster an Proteinen, die auf ihrer Oberfläche zu finden sind, identifiziert und charakterisiert werden können. Anhand dieser spezifischen Oberflächenproteine ist man in der Lage, z. B. T-Zellen von Dendritischen Zellen in einer Blut- oder Gewebeprobe zu unterscheiden. Als Methode der Wahl hat sich hierfür die sogenannte Durchflusszytometrie (Zytometrie = Zellvermessung) etabliert. Hierbei werden Antikörper eingesetzt, die entsprechende Oberflächenproteine (z. B. das Protein Clec9A auf einer bestimmten Untergruppe von Dendritischen Zellen) in einer Zellsuspension hochspezifisch erkennen. Zur Visualisierung dieser Bindung sind die eingesetzten Antikörper mit Farbstoffen, den sogenannten Fluorochromen, konjugiert.

Die „gefärbte“ Mischung von Einzelzellen (auch Zellsuspension genannt) wird nun in dem sogenannten Durchflusszytometer eingelesen. Der Prozess der „hydrodynamischen Fokussierung“ erlaubt die Vereinzelung der Zellen. Mithilfe der in einem Durchflusszytometer eingebauten Laser werden die an den Zellen haftenden Antikörper-Fluorochrom-Komplexe angeregt und das emittierte (abgestrahlte) Licht gemessen. Im Übrigen kommen Fluorochrom-konjugierte Antikörper neben der Durchflusszytometrie auch in der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, wo mit ihrer Hilfe Gewebestrukturen und sogar einzelne Zellen visualisiert werden können [1]. Vorläufermodelle von Durchflusszytometern konnten nur sehr wenige (maximal vier) Fluorochrome getrennt voneinander darstellen. Dementsprechend war man bei der gleichzeitigen Detektion bestimmter Zellen stark limitiert. Doch im Laufe der letzten 10-15 Jahre hat sich diese Technik stark weiterentwickelt, sodass nun weit mehr als vier Fluorochrome gleichzeitig detektiert werden können.

 
Methode
 
Das in dieser Studie eingesetzte Durchflusszytometer (LSR Fortessa, Becton Dickinson) verfügt über zwei Diodenlaser (405 nm und 640 nm) und drei Feststofflaser (355 nm, 488 nm und 561 nm), welche die Zellen mit einem minimalen Zeitversatz von wenigen µs nacheinander passieren müssen. Hierdurch werden die an die Antikörper gekoppelten Fluorchrome, welche an der Zelloberfläche haften, angeregt, woraufhin sie Licht einer für sie spezifischen Wellenlänge emittieren. Durch eine Glasfaseroptik werden diese Lichtsignale zu aufwändigen Filteroptiken weitergeleitet, in denen sie „sortiert“ werden. Hierbei kommt für jeden der fünf Laser eine Trigon- oder Octagon-Technologie zum Einsatz, in der bis zu drei bzw. acht unterschiedliche Fluorochrome getrennt voneinander dargestellt werden können. Sogenannte „Longpass-Filter“ leiten nur Lichtsignale ab einer klar definierten Wellenlänge weiter, welche mittels eines „Bandpass-Filters“ zusätzlich eingeengt werden, bevor sie schließlich durch einen Detektor registriert und von diesem als digitale Signale dargestellt werden. Licht einer kürzeren Wellenlänge wird am „Longpass-Filter“ gespiegelt und trifft schließlich auf die nächste Filterkombination (Abb. 1). Aufgrund der in diesem Durchflusszytometer eingesetzten Laser und Filtersysteme ist es möglich, 20 Parameter parallel darzustellen. Hierzu zählen auch die Größe (forward scatter, FSC) und Granularität (side scatter, SSC) der in der Probe befindlichen Zellen. Die restlichen 18 Kanäle können mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern oder Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. DAPI) besetzt werden (Abb. 2). 
 
Die besondere Herausforderung bei der Arbeit mit einem Multiparameter-Durchflusszytometer liegt in der Auswahl und Zusammenstellung dieser „Antikörper-Cocktails“. Wie bei einem guten Drink sind auch hier die einzelnen Zutaten von entscheidender Bedeutung. Der Auswahl der passenden Fluorochrome kommt eine wesentliche Rolle zu. Alle Fluorochrome zeichnen sich durch eine für sie charakteristische Extinktions- und Emissionswellenlänge (Anregungs- und Abstrahlungswellenlänge) aus. Da sich der Emissionswellenlängenbereich des einen mit dem eines anderen Fluorochroms teilweise überschneiden kann, müssen diese vor dem Beginn des eigentlichen Experiments zunächst gegeneinander „kompensiert“ werden. Hierbei wird für jedes verwendete Fluorochrom in einer Einzelfärbung ermittelt, inwieweit es in den Kanal des anderen Fluorochroms hineinstrahlen und letztendlich vom dortigen Detektor als Signal registriert werden könnte. In einer sogenannten Kompensations-Matrix werden somit alle verwendeten Fluorochrome gegeneinander korrigiert.
 
In Abbildung 3 ist exemplarisch eine „Gating-Strategie“ des menschlichen Blutes dargestellt, mit der Proben auf die oben beschriebenen „Muster“ an Oberflächenproteinen analysiert werden. Auf diese Weise kann man die einzelnen Zellarten des Immunsystems identifizieren und weiter untersuchen. So war es in unserem Fall möglich, viel über die Biologie von Dendritischen Zellen in menschlichen Organen zu lernen. Dendritische Zellen werden auch als die „Wächter des Immunsystems“ bezeichnet und befinden sich an der Schnittstelle zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem. Durch aufwändige Studien konnten gezeigt werden, dass die Dendritischen Zellen in humanem Blut, Milz und Thymus eine große Ähnlichkeit untereinander haben [2]. Eine andere Studie, die ebenfalls kürzlich publiziert wurde, beschreibt, wie im Mausmodell mithilfe bestimmter Oberflächenproteine gezielt Immunantworten ausgelöst werden können. Diese Proteine (sogenannte Fc-Rezeptoren oder C-Typ Lektinrezeptoren) auf Dendritischen Zellen können als Andockstellen für Antikörper verwendet werden. Letztere tragen pathogenspezifische Substanzen wie in einem Rucksack mit sich, welche nach Bindung an die Andockstellen in die Dendritischen Zellen aufgenommen werden, woraufhin gezielte Immunreaktionen gestartet werden können [3].
 
Fazit
 
Die Durchflusszytometrie stellt eine elementare Methode in der immunologischen Forschung dar. Durch die gleichzeitige Detektion von 20 verschiedenen Parametern ist es möglich, unterschiedliche Zellen des Immunsystems gezielt zu untersuchen. Dies ist besonders bei sehr wertvollen Proben oder kleinen Proben von entscheidender Bedeutung.
 
Danksagung
 
Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und dem Land Bayern für ihre finanzielle Unterstützung zur Anschaffung eines LSRFortessa Durchflusszytometers (INST 410/43-1 FUGG). Darüber hinaus bedanken wir uns bei der Bayerischen Akademie der Wissenschaften, dem Bayerischen Genomforschungsnetzwerk (BayGene), dem SFB643 und dem SFB1181, sowie der intramuralen Förderung durch das IZKF und den ELAN Fonds.
 
Zugehörigkeit
1Universitätsklinikum Erlangen, Hautklinik, Kussmaul-Forschungscampus, Labor für Biologie Dendritischer Zellen, Erlangen, Deutschland
 
Kontakt 
Prof. Dr. Diana Dudziak
Universitätsklinikum Erlangen
Hautklinik
Kussmaul-Forschungscampus
Labor für Biologie Dendritischer Zellen
Erlangen, Deutschland
 
Mehr Infos zur Durchflusszytometrie: http://www.facs-and-more.de/index.html
 
PDF zur Durchflusszytometrie: http://bit.ly/Durchflusszyt
 

Literatur
[1] Eissing et al.: Easy performance of 6-color confocal immunofluorescence with 4-laser line microscopes, Immunology letters (2014)
[2] Heidkamp, Sander et al.: Human lymphoid organ dendritic cell identity is predominantly dictated by ontogeny, not tissue microenvironment, Science Immunology (2016)
[3] Lehmann et al.: DC subset specific induction of T cell responses upon antigen uptake via Fcγ receptors in vivo, Journal of Experimental Medicine (2017)

 

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