Durch die Belastung mit in verschmutzter Luft enthaltenem Ozon und Stickoxiden kommt es zu einer Nitrierung der Tyrosinreste von Proteinen. Diese posttranslationale Modifikation von Proteinen kann Immunreaktionen auslösen und liefert eine molekulare Begründung für die Förderung von Allergien durch verkehrsbedingte Luftverschmutzung [1].

Motivation
Labor- und Feldexperimente zeigen, dass Proteine effektiv nitriert werden, wenn sie Gasmischungen aus Stickoxiden und Ozon oder verschmutzter Stadtluft (Sommersmog) ausgesetzt sind. Hierbei kommt es zur Bindung von Nitrogruppen an die aromatischen Ringe der Tyrosinreste der Polypeptidkette. Diese posttranslationale Modifikation kann das allergene Potential von Proteinen, wie dem Birkenpollenallergen Bet v 1, verstärken [2, 3]. Auch Allergene in Nahrungsmitteln, wie das in Eiern enthaltene Allergen Ovalbumin (OVA), führen nach einer Nitrierung zu einer erhöhten Allergenität [4].

Die Kinetik der Proteinnitrierung sowie das Dosis-Wirkungsverhältnis für nitrierte Proteine und Allergien sind jedoch nicht genau bekannt. Für ihre Untersuchung ist die Entwicklung und Anwendung geeigneter analytischer Methoden erforderlich.

Analytische Techniken
Hochdurchsatz-Flüssigchromatographie gekoppelt mit einem Diodenarray-Detektor für die Messung der Lichtabsorption im ultravioletten und visuellen Bereich (HPLC-DAD) kann zur Quantifizierung von Nitrotyrosinresten bei Proteinmolekülen verwendet werden [5]. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Bestimmung des durchschnittlichen Nitrierungsgrades bei kinetischen Untersuchungen zur Proteinnitrierung. Allerdings sind zur Klärung von Reaktionsmechanismen und Strukturinformation zusätzlich positionsspezifische Informationen erforderlich.

Für die positionsspezifische Quantifizierung des Nitrierungsgrades der individuellen Tyrosinreste kann nach einer Trypsinverdauung der nitrierten Proteine ein Mikrofluid-Chipsystem mit Elektrospray-Ionisierung und Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) eingesetzt werden [6]. Die Nitrierungsgrade der individuellen Tyrosinreste liefern Informationen über die Selektivität der Position, an welcher die Nitrierungsreaktion abläuft.

Beide analytische Methoden sind in Abb. 1 dargestellt.

Proteinnitrierung und Positionsselektivität
Neueste Studien untersuchten die Selektivität der Nitrierungsposition und deren Abhängigkeit von Nitrierungsreagenz und Proteinstruktur für Rinderserumalbumin (BSA) und OVA. In diesen Studien wurden zwei verschiedene Nitrierungsverfahren untersucht (Abb. 2): Die Reaktion von Protein in wässriger Lösung mit flüssigem Tetranitromethan (TNM) und die Reaktion von festem Protein mit einer Gasmischung aus O3 und NO2 in synthetischer Luft. Die mittels HPLC-MS/MS bestimmten Nitrierungsgrade der individuellen Tyrosinreste (NDY) zeigten positive Korrelationen mit dem durch HPLC-DAD ermittelten Gesamtproteinnitrierungsgrad (ND), was die Anwendbarkeit und die Robustheit beider Techniken bestätigt. Das Verhältnis von NDY zu ND kann stellvertretend für die relative Rate oder Reaktionswahrscheinlichkeit individueller Tyrosinreste interpretiert werden [6].

Bei der Reaktion in der flüssigen Phase von BSA mit TNM waren die Tyrosinreste an den Positionen 161, 173 und 424 reaktiver als andere (NDY/ND > 2). Bei der heterogenen Reaktion von BSA mit O3 und NO2 war der Tyrosinrest an Position 161 am reaktivsten. Bei dem Nahrungsmittel-Allergen Ovalbumin (OVA) war der am effizientesten von TNM nitrierte Tyrosinrest (Tyr 107, Abb. 3) Teil eines Epitops, das nach oraler Sensibilisierung erkannt wird [4].

Struktur nitrierter Proteine und Reaktionsmechanismus
Die Online-Programme PredictProtein (http://predictprotein.org) [7] und PDB Protein Workshop 3.9 [8] wurden zur Darstellung der 3D-Struktur von OVA verwendet und die am häufigsten nitrierten Tyrosinreste hervorgehoben (Abb. 3). Die Tyrosinreste 107 und 282 liegen in der β-Faltblatt-Struktur, während der Tyrosinrest 112 an einem Loop lokalisiert ist. Beim Vergleich mit humanem Serumalbumin (HSA) könnten die am häufigsten nitrierten Tyrosinreste bei BSA Loop- und Helix-Strukturen zugeordnet werden [6].

Neuste Experimente zeigen, dass die Reaktion von Proteinen mit O3 und NO2 über die Bildung von langlebigen reaktiven Sauerstoffzwischenformen (ROIs) abläuft, am wahrscheinlichsten sind Phenoxyderivate von Tyrosin [10]. Die ROIs können über einen längeren Zeitraum bestehen (bis zu 10 min) und mit NO2 zu Nitrotyrosin reagieren (Abb. 2b). ROIs spielen nicht nur bei der Proteinnitrierung eine wichtige Rolle, sondern auch bei anderen atmosphärischen und physiologischen Prozessen (Abb. 4).

Ausblick
Die Bestimmung der Nitrierungspositionen von allergenen Proteinen kann zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Immunsystem und Allergenen führen. Zum Beispiel scheint die Nitrierung von IgE- und T-Zell-Epitopen bei nitriertem Ei-Allergen Ovalbumin einen starken Einfluss auf die Allergenität zu haben [4].  Aus diesem Grund empfehlen und beabsichtigen wir weitere Untersuchungen der Reaktionskinetik und der Mechanismen der Proteinnitrierung mit Hilfe der oben vorgestellten Methoden.