Polymermodifizierte magnetische Nanopartikel für die Bio- und Medizintechnik

  • Abb. 1: Herstellung der magnetischen Hybrid-Nanopartikel; A: „Grafting-Onto“-Ansatz, Abb. 1: Herstellung der magnetischen Hybrid-Nanopartikel; A: „Grafting-Onto“-Ansatz,
  • Abb. 1: Herstellung der magnetischen Hybrid-Nanopartikel; A: „Grafting-Onto“-Ansatz,
  • Abb. 2: Sichtbarmachung des Zellkerns durch Glykopolymer-modifizierte Hybrid-Nanopartikel (Aufnahme: Konfokalmikroskop).
  • Abb. 3: Magnetische Abtrennung der transfizierten Zellen von den nicht-transfizierten.
  • v. l. n. r.: Prof. Dr. Ruth Freitag, Prof. Dr. Axel H. E. Müller, Dr.  Valérie Jérôme, Dr. Holger Schmalz, Universität Bayreuth

Superparamagnetische Nanopartikel auf Basis von Maghämit (γ-Fe2O3) sind biokompatibel und lassen sich leicht in größeren Mengen herstellen. Durch chemische Modifikation lassen sich so maßgeschneiderte, multifunktionelle
Hybrid-Nanopartikel für das Sichtbarmachen intrazellulärer Strukturen, für die Gentransfektion oder die spezifische Abtrennung von Zellen und Zellinhaltsstoffen herstellen.

Herstellung der Hybrid-Nanopartikel
Superparamagnetische Nanopartikel ähneln ferromagnetischen Materialien. Aufgrund ihrer geringen Größe im Bereich von 10 nm verlieren sie aber ihre Magnetisierung, wenn ein äußeres Magnetfeld abgeschaltet wird. Die Herstellung aller hier diskutierten superparamagnetischen Hybrid-Nanopartikel beginnt mit einem Kern („core") aus Maghämit (γ-Fe2O3) Nanopartikeln, der durch thermische Zersetzung von Eisenpentacarbonyl in Gegenwart von Ölsäure als Stabilisator und anschließender Oxidation durch Luftsauerstoff produziert wird [1].

Um die Löslichkeit solcher Partikel in wässrigen Medien (z. B. Blut) zu verbessern, werden diese anschließend nachfunktionalisiert. Zur Erzeugung einer Hülle („shell") aus hydrophilen, synthetischen Polymer-Armen gibt es zwei Prinzipien (Abb. 1): Entweder man polymerisiert zunächst die Arme und koppelt diese chemisch an die entsprechend funktionalisierten γ-Fe2O3-Kerne („grafting-onto"-Ansatz) oder man funktionalisiert die γ-Fe2O3-Oberfläche mit Startermolekülen (Initiatoren) für die anschließende Polymerisation der Arme („grafting-from"-Ansatz).

Durch die Verwendung von modernen, kontrollierten Polymerisationsverfahren und Kopplungstechniken [z. B. 2,3] lassen sich so sehr homogene Materialien erzeugen, die in vielen Fällen überhaupt erst grundlegende Untersuchungen zur Funktion dieser Strukturen ermöglichen [4]. Die Core-Shell-Hybrid-Nanopartikel behalten ihre magnetischen Eigenschaften bei [5].

Sichtbarmachen interzellulärer Strukturen (Imaging)
Die exzellente Biokompatibilität der superparamagnetischen Hybrid-Nanopartikel ist im Bereich der Sichtbarmachung biologischer Strukturen (Imaging) besonders wichtig.

Hier unterscheiden sie sich z. B. von den Quantum-Dots, die toxische Schwermetalle an ihre Umgebung abgeben können [6]. Zur Herstellung von fluoreszierenden magnetischen Nanopartikeln mit Affinität zu bestimmten zellulären Strukturen [5] wurden zunächst die γ-Fe2O3-Partikel mit einer Silica-Hülle umgeben. Eine solche Hülle lässt sich leicht mit Doppelbindungen funktionalisieren, die ihrerseits in einer chemischen Reaktion (Thiol-En-Reaktion) mit den Endgruppen der gewünschten Arme reagieren („Grafting-onto"). Die Arme bestanden dabei aus einem Glycopolymer, d.h. einem synthetischen Polymer, welches Galaktose-Einheiten und fluoreszierende Pyrengruppen enthält, sowie eine endständige Thiolgruppe für die Kopplungsreaktion trägt. Die Galaktoseeinheiten besitzen eine hohe Affinität für bestimmte intrazelluläre Strukturen, z. B. Galektine.

Krebszellen neigen zur Überexpression bestimmter Galektine. In Abbildung 2 ist die spezifische Anreicherung der Galaktose-modifizierten Nanopartikel im Kern von Lungenkrebszellen (A549-Zellen) zu sehen. Die Kernmembran ist zur besseren Verdeutlichung zusätzlich mit Anti-NUP98-FITC grün angefärbt. Die konfokalmikros­kopische Aufnahme macht deutlich, dass sich die blaufluoreszierenden Nano-Partikel tatsächlich im Zellkern befinden. Neben den optischen lassen sich auch die magnetischen Eigenschaften der Partikel therapeutisch (Hyperthermie, Krebstherapie) oder diagnostisch (Magnetic Resonance Imaging, MRI) nutzen. Die hydrophile Polymerhülle verbessert die Löslichkeit der Nanopartikel im Blut. Im standardisierten Zelltoxizitätstest (ISO 10993-5, L929 Mausfibroblastenzellen) waren die Nanopartikel auch in hohen Dosen kaum toxisch.

Transfektion von Säugerzellen (Gene Delivery)
Möchte man menschliche Antikörper mit Zellkulturen herstellen, zukünftig Patienten mit Erbkrankheiten wie Mukoviszidose heilen oder möglichst effizient impfen ohne lebende Krankheitserreger zu verwenden, dann steht man vor der Aufgabe, Information in Form von DNA in den Kern von Säugerzellen einzuschleusen, diese also zu „transfizieren". Viren leisten dies sehr effizient, allerdings gibt es Sicherheitsbedenken bei ihrer Herstellung und Anwendung. Nicht-virale, synthetische Transfektionsmittel, z. B. positiv geladene Polymere oder Lipide, stellen Alternativen dar [7]. Magnetische, nicht-virale Transfektionsmittel sind bereits seit längerem bekannt. Sie kommen bei der sog. Magnetofektion zum Einsatz [8]. Allerdings wird hier das magnetische Feld zur kontrollierten Applikation der DNA-haltigen Transfektions-Komplexe genutzt. Die Methode ist daher auf den In-vitro-Einsatz an adhärenten Zellen beschränkt.

Vor kurzen wurde gezeigt, dass sich durch ein „Grafting-from"-Verfahren viele Arme von kationischem Poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylat) (PDMAEMA) an γ-Fe2O3-Partikel befestigen und so magnetische Kern-Schale-Hybridpartikel mit Molmassen > 3 MDa erzeugen lassen [9]. Diese Sterne komplexieren DNA ähnlich gut wie das bislang in der Biotechnologie dominierende Transfektionsmittel Polyethylen­imin (PEI). Bei deutlich geringerer Toxizität sind sie aber mehr als doppelt so effizient wie PEI was das Einschleusen der DNA betrifft und zwar ohne dass ein Magnetfeld zur Ausrichtung der Komplexe erforderlich wäre. Damit erweitert sich das Anwendungsspektrum magnetischer Transfektionsmittel erheblich.

Abtrennung von Zellen und Zellkomponenten
Die Verwendung magnetischer Transfektionsreagenzien hat aber auch noch weitere praktische Vorteile. Durch die Aufnahme der magnetischen Transfektions-Komplexe werden die Zellen selbst magnetisierbar. So wird es möglich, mittels eines äußeren Magnetfeldes transfizierte Zellen, d. h. Zellen, die die komplexierte DNA aufgenommen haben, von nicht transfizierten zu trennen. Hierzu wurde die Zellsuspension nach der Transfektion durch eine MACS (magnetic cell separation) Sortiersäule geleitet. Die transfizierten Zellen wurden mit hoher Effizienz in der Säule zurückgehalten und so vom Rest abgetrennt, Abbildung 3. Dabei kam es zu einer erheblichen Aufkonzentrierung dieser Zellen. Dies ist nach Wissen der Autoren das erste Mal, dass eine magnetische Anreicherung von Säugerzellen gezeigt werden konnte, ohne spezifische Liganden oder Zelloberflächenrezeptoren zu involvieren (z. B. magnetische Nanopartikel mit entsprechenden Antikörpern).

Mehr noch, auch die Transfektions-Komplexe selbst lassen sich magnetisch abscheiden. Dadurch stellen sie ein neuartiges und spezifisches „Pull-Down"-System für mit diesen Komplexen interagierende intrazelluläre Strukturen dar. Hierzu werden die Zellen mit den Komplexen transfiziert und anschließend lysiert. Die Komplexe sowie etwaig daran haftende Moleküle werden magnetisch abgetrennt und biochemisch analysiert. Dies wird in Zukunft helfen, Fragen nach den intrazellulären Vorgängen bei der genetischen Modifikation von Säugerzellen besser zu verstehen. Zuletzt sei noch angemerkt, dass polykationische „Magnetsterne" nicht nur DNA komplexieren können. Ähnliches gilt auch für andere Polynukleinsäuren wie z. B. siRNA oder synthetische Polyanionen, wie Polyacrylsäure.

Literatur
[1] Hyeon T. et al.: J. Am. Chem. Soc. 123, 12798-12801 (2001)
[2] Müllner M. et al.: Biomacromolecules 11, 390-396 (2010)
[3] Plamper F. A. et al.: Macromolecules, 40, 5689-5697 (2007)
[4] Synatschke Ch. V. et al.: Biomacromolecules 12, 4247-4255 (2011)
[5] Pfaff A. et al.: Biomacromolecules 12, 3805-11 (2011)
[6] Smith A. M. und Nie, S.: Analyst 129, 672-677 (2004)
[7] Godbey W. T. und Mikos, A.G.: J. Contr. Rel. 72, 115-125 (2001)
[8] Plank C. et al.: Adv. Drug Del. Rev 63, 1300-1331 (2011)
[9] Majewski A. P. et al.: Biomacromolecules 13, 857-66 (2012)

 

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