Spinnenseide in Bewegung

Beobachtung schneller Proteindynamik am Einzelmolekül

  • Abb. 1: pH-induzierte Selbstassoziation von Spidroinen. Die N-terminalen Domänen (N) assoziieren bei einem pH-Wert Wechsel von 7 nach 6 am Ende des Spinnkanals im Hinterleib der Webspinne. Dadurch verknüpfen sich Spidroine zu Supermolekülen. Die terminalen Domänen (N und C) sind im Vergleich zu den repetitiven Domänen (grau) überdimensioniert dargestellt. Abb. 1: pH-induzierte Selbstassoziation von Spidroinen. Die N-terminalen Domänen (N) assoziieren bei einem pH-Wert Wechsel von 7 nach 6 am Ende des Spinnkanals im Hinterleib der Webspinne. Dadurch verknüpfen sich Spidroine zu Supermolekülen. Die terminalen Domänen (N und C) sind im Vergleich zu den repetitiven Domänen (grau) überdimensioniert dargestellt.
  • Abb. 1: pH-induzierte Selbstassoziation von Spidroinen. Die N-terminalen Domänen (N) assoziieren bei einem pH-Wert Wechsel von 7 nach 6 am Ende des Spinnkanals im Hinterleib der Webspinne. Dadurch verknüpfen sich Spidroine zu Supermolekülen. Die terminalen Domänen (N und C) sind im Vergleich zu den repetitiven Domänen (grau) überdimensioniert dargestellt.
  • Abb. 2: Assoziationskinetik gemessen mittels der Stopped-Flow Technik und einem entwickelten Fluoreszenzschalter. (a) Mittels zweier Spritzen wird die fluoreszenzmarkierte NTD von pH 7 schnell in pH 6 Puffer gemischt und der Fluss in einer optischen Messzelle abrupt gestoppt. (b) Durch Proteinassoziation treten die Farbstoffe in Kontakt und löschen ihre Fluoreszenz gegenseitig. Der zeitliche Fluoreszenzabfall zeigt die Geschwindigkeit der Assoziation an.
  • Abb. 3: PET-FCS detektiert schnelle Proteindynamik. (a) Wird der Fluoreszenzfarbstoff am N-terminalen Ende der NTD eingebracht, so löscht das ein- und austretende Trp den Farbstoff bei Kontakt durch PET und die Dynamik wird als 200-µs Komponente in der Autokorrelationsfunktion G(τ) nur die Komponente der molekularen Diffusion (blau). (b) Die Bewegung des Trp (blau) aus dem Inneren des Proteins an seine Oberfläche ändert die Proteinform, sodass die NTD mit sich selbst assoziieren kann.

Spinnenseide zählt zu den stärksten Fasern der Natur. Molekulare Details zu den modular zusammengesetzten Proteinbausteinen, die die Faser bilden, sind nur bruchstückhaft bekannt. Ortsspezifisch eingebrachte Fluoreszenzfarbstoffe dienen als Sonden zur Sichtbarmachung von Proteinbewegung und -interaktion. Deren Kombination mit Stopped-Flow- und Einzelmolekülspektroskopie liefert neue Einblicke in schnelle Proteindynamik, die für hohe Synthesegeschwindigkeiten der Faser notwendig ist.

Der Seidenfaden von Webspinnen ist ein Faszinosum. Bezogen auf sein geringes Gewicht übertrifft er die Belastbarkeit synthetischer, von Menschenhand gemachter High-Tech Materialien. Ausschlaggebend hierfür ist seine außergewöhnliche Kombination von Zugfestigkeit und Dehnbarkeit. Da die Faser zum großen Teil durch nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen Proteinbausteinen zusammengehalten wird, ist dies eine besonders bemerkenswerte Leistung. Ziel biomimetischer Materialforschung ist die Nachahmung der Faser im Labor [1]. Anwendungen liegen vor allem im Bereich der Medizin, beispielsweise für Implantate oder Zellwachstum. Kenntnisse zu den Details von Aufbau und Synthesemechanismus der Faser sind für die erfolgreiche Reproduktion von Bedeutung. Der Kern der Faser besteht überwiegend aus sogenannten „Spidroinen" (von „Spider": Spinne und „Fibroin": faserbildendes Protein). Der Großteil eines Spidroins, die sogenannte repetitive Domäne, besteht aus sich wiederholenden Sequenzabschnitten einfacher Aminosäurezusammensetzung. Sie enthält viele hydrophobe und einige polare Seitenketten. Die Amino- und Carboxy-terminalen Enden eines Spidroins sind wasserlöslich und globulär gefaltet. Sie sind in der Lage mit sich selbst zu assoziieren und verknüpfen Spidroine somit zu Supermolekülen. Die Amino-terminalen Domänen (engl.: N-Terminal Domain; NTD) verknüpfen sich nach einem pH-Wert Wechsel von 7 nach 6 am Ende des Spinnkanals, kurz bevor der Seidenfaden den Hinterleib der Spinne verlässt [2]. Die molekularen Details dieses Vorgangs sind bisher wenig verstanden.

Wird ein Oxazinfarbstoff ortsspezifisch an den Rand der Wechselwirkungsoberfläche der NTD eingebracht, so lässt sich die pH-getriebene Selbstassoziation der helikalen Domäne fluoreszenzspektroskopisch beobachten [3].

Für GIT-Labor Nutzer!!!

Hier kostenlos Registrieren!

Die Labvolution mit Biotechnica vom 16. - 18. Mai in Hannover, ist ein Messe und Konferenz für Anwender und Hersteller von analytischen Geräten, Laborausstattung und Biotechnologie sowie Bioprozesstechnik. Die Veranstaltung bildet neben vielen weiteren Veranstaltungen den Rahmen für das Projekt "Smartlab", indem die Zukunft der Laborbranche schon heute im Betrieb gezeigt wird.

Hierfür wird eine bestimmte Aminosäureseitenkette durch ortsspezifische Mutagenese ausgetauscht und nachfolgend chemisch mit dem Farbstoff modifiziert. Bei Selbstassoziation des Proteins kommen die Farbstoffmoleküle in Kontakt und löschen ihre Fluoreszenz gegenseitig. Ursache hierfür ist die Verteilung der Anregungsenergie über beide Chromophore und die daraus resultierende, stark veränderte Photophysik. Mit Hilfe der „Stopped-Flow" Technik kann ein schneller pH-Wert Wechsel herbeigeführt werden, ähnlich wie er im Spinnkanal der Webspinne stattfindet, und die Reaktion mit einer Zeitauflösung von 1 ms verfolgt werden [3]. Die beobachtete Assoziationsgeschwindigkeit der NTD ist etwa 1000-mal schneller als gewöhnliche Protein-Protein Wechselwirkungen, wie sie beispielweise zwischen einem Antigen und einem Antikörper stattfindet. Die hohe Geschwindigkeit wird vermutlich durch eine ungleiche Verteilung entgegengesetzt geladener Aminosäure Seitenketten auf der Proteinoberfläche gesteuert. Diese erzeugt einen makromolekularen Dipol, der die beschleunigte Assoziation durch elektrostatische Wechselwirkung herbeiführt. Somit ist gewährleistet, dass die Spinne stabile Seidenfäden auch mit hoher Geschwindigkeit synthetisieren kann. Dies ist vor allem beim Abseilen und auf der Flucht von überlebenswichtiger Bedeutung.

Oxazin- und Rhodamin-basierte Fluoreszenzfarbstoffe werden effizient bei van der Waals Kontakt mit der Seitenkette der natürlichen Aminosäure Tryptophan (Trp) gelöscht [4]. Beim Löschmechanismus handelt es sich um einen photoinduzierten Elektronentransfer (PET) von Trp zum Farbstoffmolekül im elektronisch angeregten Zustand. Natives Trp im Protein kann somit als selektives Löschmolekül eingesetzt werden. Alternativ kann Trp leicht über ortsspezifische Mutagenese an die gewünschte Position gebracht werden. Da Farbstoff und Trp bei einem räumlichen Abstand von ≤ 1 nm in Kontakt treten, stellt das Reporter-System eine Sonde für lokale Konformationsänderungen dar. Beobachtet man das Fluoreszenzsignal Farbstoff/Trp-modifizierter Proteine in hochverdünnter Lösung mit Hilfe eines konfokalen Einzelmolekül-Mikroskops, so lässt sich lokale Proteindynamik sichtbar machen. Das PET Reporter System übersetzt Proteinbewegung in Fluoreszenzfluktuationen. Die Signale einzelner Protein-Moleküle, die durch das Detektionsvolumen diffundieren, werden mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) mit Nanosekunden Zeitauflösung analysiert [4]. Strukturelle Arbeiten zeigen, dass die NTD der Raubspinne bei Selbstassoziation ihre Form ändert [5]. Ein im Zentrum des Proteins liegendes Trp scheint die Anordnung der Helices so zu verändern, dass sich die Komplementarität der Wechselwirkungsoberflächen aufhebt: „Schlüssel" und „Schloss" passen nicht mehr zueinander. Wandert das Trp an die Proteinoberfläche, so ändert sich die Gestalt des Proteins und es kann wieder mit sich selbst interagieren: Der „Schlüssel" passt zum „Schloss". Atomare Kristallstrukturen des Proteins liefern jedoch nur einen Schnappschuss des Vorgangs. Spielen sich diese Konformationsänderungen im Spinnkanal wirklich ab? PET-FCS Daten zeigen, dass das Trp tatsächlich aus dem Kern des Proteins an die Oberfläche tritt und wieder eintaucht, mit einer Geschwindigkeit von etwa 200 µs [6]. Die Evolution hat bei der Spinnenseide einen ausgeklügelten Schaltmechanismus entwickelt, der die Selbstassoziation einer Domäne über Konformationsänderung steuert.

Kontaktgeschaltete Fluoreszenzsonden und deren Kombination mit Einzelmolekülspektroskopie liefern neue Einblicke in die Funktionsdynamik von Proteinen. Die Aufklärung molekularer Mechanismen der Spinnenseidensynthese, untersucht an konstituierenden Proteinbausteinen, kann die biomimetische Rekonstruktion im Labor unterstützen.

Literatur
[1] Heim M. et al.: Angew Chem Int Ed Engl 48, 3584-96 (2009)
[2] Hagn F. et al.: Angew Chem Int Ed Engl 50, 310-3 (2011)
[3] Schwarze S. et al.: Nat Commun 4, 2815 (2013)
[4] Sauer M. und Neuweiler H.: Methods Mol Biol 1076, 597-615 (2014)
[5] Jaudzems K. et al.: J Mol Biol 422, 477-87 (2012)
[6] Ries J. et al.: J Am Chem Soc 136, 17136-44 (2014)

 

Autor(en)

Kontaktieren

Universität Würzburg

97074 Würzburg
Germany

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.

Für GIT-Labor Nutzer!!!

Hier kostenlos Registrieren!

Die Labvolution mit Biotechnica vom 16. - 18. Mai in Hannover, ist ein Messe und Konferenz für Anwender und Hersteller von analytischen Geräten, Laborausstattung und Biotechnologie sowie Bioprozesstechnik. Die Veranstaltung bildet neben vielen weiteren Veranstaltungen den Rahmen für das Projekt "Smartlab", indem die Zukunft der Laborbranche schon heute im Betrieb gezeigt wird.