Struktur kleinster Gefäßnetzwerke

Registrierung von Serienschnitten zur 3D Rekonstruktion

  • Rekonstruktion des Gefäßnetzwerkes in der Umgebung zweier Follikel in der humanen Milz. Nicht miteinander verbundene Gefäße sind in unterschiedlichen Farben dargestellt.Rekonstruktion des Gefäßnetzwerkes in der Umgebung zweier Follikel in der humanen Milz. Nicht miteinander verbundene Gefäße sind in unterschiedlichen Farben dargestellt.
  • Rekonstruktion des Gefäßnetzwerkes in der Umgebung zweier Follikel in der humanen Milz. Nicht miteinander verbundene Gefäße sind in unterschiedlichen Farben dargestellt.
  • Abb. 1: Rekonstruktion des Gefäßnetzwerkes im humanen Knochenmark mit eingeblendetem Schnitt zur Verifikation. Dickere Gefäße (Sinus) sind grün und dünnere (Kapillaren) rot eingefärbt.
Auch mit den neusten bildgebenden Techniken in der Medizin war es bisher nicht möglich kleinste Blutgefäße, die in Organen wie der Milz oder dem Knochenmark bei Menschen enthalten sind, hochauflösend darzustellen. Ein neues Verfahren zur Registrierung immunhistologisch gefärbter Serienschnitte macht dies nun möglich. Damit ist es nun möglich, das hochkomplexe Netzwerk dieser Blutgefäße in Gewebeproben dreidimensional sichtbar zu machen.
 
Einführung
 
Bei der in der Medizin und der Biologie gängigen Immunhistologie werden mit Hilfe von Antikörpern zellspezifische Glykoproteine in Gewebeschnitten angefärbt. Damit können Moleküle, die nur in Zellen der Innenauskleidung kleinster Blutgefäße (Kapillaren) verkommen, sichtbar markiert werden. Dies ist jedoch nur mit Hilfe feiner Scheiben möglich, die mit einem speziellen Schneidegerät (Mikrotom) aus einer Gewebeprobe hergestellt werden und meist 5 bis 7 Mikrometer dick sind. Für die weitere digitale Verarbeitung werden diese Gewebeschnitte zunächst mit einem optischen Scanmikroskop fotografiert.
 
Anschließend müssen die Bilder vieler aufeinanderfolgender Schnitte exakt übereinandergelegt werden, um den dreidimensionalen Verlauf der Blutgefäße zu rekonstruieren. Da die Schnitte extrem dünn sind, wird das Gewebe jedoch beim Schneiden deformiert. Dies ist ein großes Problem, da unterschiedliche Verzerrungen innerhalb jedes einzelnen Schnitts auftreten und sich so aneinandergrenzende Schnitte einer Serie lassen nicht mehr korrekt zusammenfügen lassen. Zunächst müssen zusammengehörige Regionen in angrenzenden Schnitten detektiert und dann die einzelnen Schnitte digital entzerrt werden [1]. Anschließend kann durch Segmentierung der einzelnen Farben eine dreidimensionale Rekonstruktion der Gefäßverläufe aus den registrierten Serienschnitten erstellt werden [2].
 
Registrierung und Entzerrung
 
Durch die hohe Auflösung der Scanning Mikroskope und die Größe der untersuchten Regionen haben die Bilder der Serienschnitte eine Auflösung von mehr als 1000 Megapixeln (z.B.

30000 x 40000 Pixel). Zunächst müssen die Schnitte grob aneinander ausgerichtet werden, da sie von Hand auf den Objektträger aufgebracht wurden und daher nicht konsistent orientiert sind. Dazu wird die Rotation und Verschiebung der Schnitte zueinander berechnet, die jedoch nicht die beim Schneiden entstandenen Deformationen ausgleicht. Zur Entzerrung wird die Probe mathematisch als deformierbare Fläche durch eine B-Spline Fläche dargestellt, wie sie häufig im Computer Aided Design verwendet wird. Die Entzerrung wird dabei in mehreren Auflösungsstufen durchgeführt. Auf jeder Stufe wird dabei Gesamtverzerrung aller Schnitte minimiert, um so die ursprüngliche Form möglichst gut wiederherzustellen. Dazu muss auf Grund der gewählten Darstellung lediglich ein lineares Gleichungssystem gelöst werden, wodurch das Verfahren auch für derart hohe Auflösungen anwendbar ist.

 
Sowohl für die Ausrichtung, als auch für die Entzerrung wird ein Feature-Matching Ansatz verwendet. Dazu werden zunächst markante Bildregionen mit Hilfe von Featuredetektoren, wie SIFT oder SURF bestimmt. Da die Features auch eine Beschreibung ihrer Umgebung enthalten, können sie auf ihre Ähnlichkeit verglichen werden. Im ersten Schritt wird dann eine Rotation und Verschiebung gesucht, die möglichst viele Features zweier benachbarter Schnitte aufeinander legt. Für die Entzerrung müssen dann nur noch Features in benachbarten Schnitten berücksichtigt werden, die sowohl ähnlich sind, als auch nahe beieinanderliegen. Neben einem reduzierten Aufwand bei der Suche nach korrespondierenden Features löst dies vor allem das Problem der Mehrdeutigkeit, die auf Grund der hohen Selbstähnlichkeit der Gewebestrukturen auftritt. Mit jeder Erhöhung der Auflösung wird zum einen das Kontrollgitter verfeinert und zum anderen die Größe der betrachteten Features reduziert. Außerdem kann dabei der Suchradius für die korrespondierenden Features verkleinert werden, da größere Deformationen bereits auf der gröberen Auflösung ausgeglichen wurden.
 
Das Ergebnis dieser Berechnungen ist eine Serie von Schnittbildern, die sehr gut aufeinanderpassen. Nach dieser Registrierung und Entzerrung können die Schnitte zu einem dreidimensionalen Volumendatensatz zusammengefügt werden. Dieser kann dann direkt visualisiert oder weiterverarbeitet werden.
 
Dreidimensionale Rekonstruktion
 
Die Bilddaten werden nach der Registrierung und Entzerrung zunächst gefiltert und bereinigt. Anschließend können die Oberflächen der Gefäße aus den Volumendaten extrahiert werden. Dazu werden die Pixel zunächst klassifiziert, d.h. es wird bestimmt ob und mit welchem Farbstoff der Punkt angefärbt ist. Dann wird für jeden einzelnen Farbstoff eine Dichtverteilung im Volumen ermittelt und eine sogenannte Isofläche an der Grenze zwischen gefärbtem und ungefärbtem Bereich bestimmt. Die Isofläche wird dann durch ein Dreiecksnetz approximiert. Da die erzeugte Fläche zur Darstellung und weiteren Verarbeitung zu viele Dreiecke enthält, wird anschließend die Dreiecksanzahl durch einen Vereinfachungsalgorithmus reduziert. Dabei wird zu einer vorgegebenen Genauigkeit (üblicherweise die halbe Pixelauflösung) ein Modell mit möglichst wenigen Dreiecken erzeugt.
 
Bei der Extraktion der Oberfläche als Dreiecksnetz werden auch die Größenverhältnisse der Blutgefäße wirklichkeitsgetreu abgebildet. Durch die 3D Rekonstruktion wird die Form und Lage der Blutgefäße in biologischen Proben viel klarer als in einzelnen Schnitten. Die Genauigkeit und Korrektheit der Rekonstruktionen wird abschließen durch Überlagerung einzelner Serienschnitte mit den rekonstruierten Flächen validiert.
 
Das Verfahren ist für die medizinische Grundlagenforschung, die das komplexe Geflecht von Blutgefäßen in der Milz und im Knochenmark bis heute nicht präzise durchschaut hat, von großem Interesse. Für den Einsatz in der medizinischen Diagnostik ist es allerdings beim derzeitigen Stand der Technik noch zu langsam, weil enorme Datenmengen verarbeitet werden müssen. Mit Hilfe der 3D Rekonstruktionen konnte z.B. entdeckt werden, dass die feinsten Blutgefäße in der Milz offen enden und das Blut für eine kurze Strecke außerhalb von Blutgefäßen fließt. Es hat sich auch herausgestellt, dass im blutbildenden Knochenmark des Beckenkamms die beiden bisher bekannten Arten feinster Blutgefäße (Kapillaren und Sinus) nicht hintereinander, sondern nebeneinander verlaufen [2]. In der Immunhistologie wurde aufgeklärt welche Antikörper verwendet werden müssen, um beide Gefäßarten gleichzeitig nachzuweisen und somit die feinsten Gefäße im Knochenmark vollständig darzustellen.
 
Das Forschungsprojekt ist nicht zuletzt dadurch ermöglich worden, dass die Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie des Klinikums der Philipps- Universität Marburg, im Einverständnis mit den Patienten und mit der zuständigen Ethikkommission, Knochenproben aus dem Beckenkamm zur Verfügung gestellt hat. Diese Proben waren bei Operationen angefallen, bei denen Knochendefekte mit Material aus dem Beckenkamm behoben wurden. Weitere Gewebeproben stammten von Patienten, denen die Milz wegen eines lebensbedrohlichen Risses bei einer Bauchverletzung entnommen werden musste.
 
Anwendung in der Forschung
 
Das System soll als nächstes zur Erforschung der lymphatischen Organe, beispielsweise der Mandeln, und zur Untersuchung von speziellen Gefäßabschnitten in der Milz eingesetzt werden. Besonderes Interesse liegt dabei auf den Lymphozyten. Diese für die Immunabwehr entscheidenden weißen Blutkörperchen bilden in den lymphatischen Organen rundliche Ansammlungen, sogenannte Follikel. Lymphfollikel haben ungefähr einen Millimeter Durchmesser, was in der Mikroskopie eine enorme Größenordnung ist, die nur mit vielen hundert Serienschnitten zu erreichen ist. Daher ist die Entwicklung weiterer Verfahren nötig, um die Anzahl an Schnitten zu reduzieren und so die verschiedenen Zellarten in einem ganzen Follikel zu analysieren. Ziel ist zu klären, wie Lymphozyten in Follikeln bei Immunreaktionen zusammenarbeiten und auf welchen Wegen sie ins Gewebe und in die Schleimhäute wandern.
 
Autoren
Michael Guthe1, Oleg Lobachev1, Birte S. Steiniger2
 
Zugehörigkeiten
1 Graphische Datenverarbeitung, Universität Bayreuth, Bayreuth, Germany
2 Institut für Anatomie und Zellbiologie, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Germany
 
Kontakt   
Prof. Dr. Michael Guthe
Universität Bayreuth
Graphische Datenverarbeitung
Bayreuth, Deutschland
 

 

[1] Oleg Lobachev, Christine Ulrich, Birte S. Steiniger, Verena Wilhelmi, Vitus Stachniss, Michael Guthe, Feature-based multi-resolution registration of immunostained serial sections. Medical Image Analysis (2017) 35, doi:10.1016/j.media.2016.07.010.

[2] Birte S. Steiniger, Vitus Stachniss, Verena Wilhelmi, Anja Seiler, Katrin Lampp, Andreas Neff, Michael Guthe, Oleg Lobachev, Three-dimensional arrangement of human bone marrow microvessels revealed by immunohistology in undecalcified sections. PLOS ONE (2016) 11, e0168173, doi:10.1371/journal.pone.0168173.

 

 

 

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