UCNPs: Aus zwei Photonen mach eins

Photonen-aufkonvertierende Nanopartikel eröffnen neue Wege zur optischen Markierung

  • Abb. 1: A Photonen-aufkonvertierende Nanopartikel (UCNPs) unter dem Transmissionselektronenmikroskop. Die 12 nm-großen Partikel bestehen aus einem hexagonalen NaYF4-Wirtsgitter. Die Dotierung mit Ytterbium- und Erbium-Ionen ermöglicht die höchste bisher bekannte Aufkonvertierungseffizienz. B: Unter Nahinfrarot-Anregung (980 nm) emittieren diese UCNPs grünes und rotes Licht (Anti-Stokes-Verschiebung).Abb. 1: A Photonen-aufkonvertierende Nanopartikel (UCNPs) unter dem Transmissionselektronenmikroskop. Die 12 nm-großen Partikel bestehen aus einem hexagonalen NaYF4-Wirtsgitter. Die Dotierung mit Ytterbium- und Erbium-Ionen ermöglicht die höchste bisher bekannte Aufkonvertierungseffizienz. B: Unter Nahinfrarot-Anregung (980 nm) emittieren diese UCNPs grünes und rotes Licht (Anti-Stokes-Verschiebung).
  • Abb. 1: A Photonen-aufkonvertierende Nanopartikel (UCNPs) unter dem Transmissionselektronenmikroskop. Die 12 nm-großen Partikel bestehen aus einem hexagonalen NaYF4-Wirtsgitter. Die Dotierung mit Ytterbium- und Erbium-Ionen ermöglicht die höchste bisher bekannte Aufkonvertierungseffizienz. B: Unter Nahinfrarot-Anregung (980 nm) emittieren diese UCNPs grünes und rotes Licht (Anti-Stokes-Verschiebung).
  • Abb. 2: Oberflächenfunktionalisierung von UCNPs. A: Nicht kovalente Modifizierung durch Ligandenaustausch von hydrophoben Oberflächenliganden durch hydrophile Liganden, die eine weitere Kopplung an Biomoleküle wie z. B. Antikörper (blau) oder Enzyme (rot) ermöglichen. B: Beschichtung von UCNPs mit Siliziumdioxid und Silanisierung mit funktionalisierten Silanen, die für die Konjugation an Antikörper (blau) oder Enzyme (rot) geeignet sind.
  • Abb. 3: Feineinstellung der Emission von Yb3+/Er3+-dotierten UCNPs zur Mehrfachmarkierung. A: Die grüne Emission wird in 10 Stufen gelöscht (Icode), indem der Farbstoff Rhodamin B in unterschiedlichen Konzentrationen an die Oberfläche der UCNPs gebunden wird. Die rote Emission wird dagegen nicht von Rhodamin B gelöscht und dient als konstanter Referenzwert (Iref). Der Auftrag von -log (Icode/Iref) gegen die Farbstoffkonzentration ergibt einen linearen Zusammenhang. B: Anstelle der grünen Emission kann auch die rote Emission durch den Farbstoff S 0378 stufenweise eingestellt werden. In diesem Fall dient die grüne Emission als Referenzwert. Abbildung modifiziert nach Ref. [11].

Photonen-aufkonvertierende Nanopartikel (upconverting nanoparticles, UCNPs) bieten neue und vielversprechende Möglichkeiten zur optischen Markierung in biologischen und medizinischen Anwendungen. Aufgrund ihrer einzigartigen lumineszenten Eigenschaften lassen sich durch den Einsatz von UCNPs in biologischen Proben viele Nachteile von üblichen optischen Markierungen wie z. B. organischen Fluorophoren oder Quantenpunkten vermeiden. Diese Nanopartikel werden mit Nahinfrarot (NIR)-Licht angeregt und emittieren sichtbares Licht (Anti-Stokes Verschiebung). Durch die Anregung mit NIR-Licht wird sowohl die Eigenfluoreszenz als auch die Lichtstreuung von biologischen Materialien drastisch reduziert. Zudem wird NIR-Licht kaum von biologischen Materialien absorbiert, wodurch eine hohe Eindringtiefe der Strahlung und geringe Photoschäden an der biologischen Probe gewährleistet sind.

Für die Beobachtung biologischer Strukturen und biochemischer Prozesse oder für bioanalytische Anwendungen werden häufig optische Markierungen eingesetzt. Auf Fluoreszenz bzw. Lumineszenz basierende Methoden haben den Vorteil, dass sie sowohl eine relativ geringe Nachweisgrenze besitzen als auch eine Bildgebung durch Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen. Voraussetzung für eine effiziente optische Markierung ist die Verfügbarkeit von geeigneten Luminophoren. Momentan werden hierfür vor allem organische Moleküle oder Quantenpunkte verwendet, die sichtbares Licht emittieren, wenn sie mit ultraviolettem oder sichtbarem Licht angeregt werden. Während bei Quantenpunkten die Emissionswellenlänge von der Größe abhängt und sich somit Markierungen mit verschiedene nEmissionsfarben herstellen lassen, ist die Emissionswellenlänge organischer Fluorophorein einem gegebenen Lösungsmittel weitgehend konstant. Gemeinsames Merkmal dieser beiden Markierungstypen ist die Stokes-Verschiebung, d. h. das Emissionslicht ist längerwellig und somit energieärmer als das Anregungslicht. Die Anregung mit kurzwelligem Licht führt allerdings zu Eigenfluoreszenz und Lichtstreuung in biologischen Proben. Hierdurch wird insbesondere bei empfindlichen Messungen der Signalhintergrund so stark erhöht, dass es schwierig ist, das Lumineszenzsignal des Analyten vom Hintergrund zu unterscheiden.

Zudem verursacht das energiereichere kurzwellige Licht stärkere Photoschäden, die sowohl die Struktur als auch die Funktion verschiedener biologischer Komponenten beeinträchtigen können.

Vorteile der UCNPs
Die Einschränkungen konventioneller optischer Markierungen lassen sich elegant durch die Verwendung von UCNPs vermeiden, die zwei oder mehr Photonen energieärmeren NIRLichts ( λ = 980 nm) absorbieren und daraufhin sichtbares Licht emittieren (Anti-Stokes-Verschiebung). Bei diesen Nanopartikeln handelt es sich um anorganische Nanokristalle mit einem Durchmesser von10 - 100 nm. Im Gegensatz zu Quantenpunkten ist die Emission der UCNPs aber nicht abhängig von ihrer Größe, sondern von der Dotierung. Sie bestehen aus einem Wirtsgitter, z. B. Oxiden oder Halogeniden, das mit genau definierten Mengen an Lanthanoid-Ionen dotiert ist. Die höchste bisher bekannte Aufkonvertierungseffizienz wird durch die Verwendung von NaYF4 mit einer hexagonalen Kristallstrukturals Wirtsgitter erreicht (Abb.1A). Zur Dotierung werden unter anderem Ytterbium (Yb3+), Erbium (Er3+), Holmium (Ho3+) und Thulium (Tm3+) verwendet. Ytterbium, das als sogenanntes Sensibilisator-Ion dient, absorbiert IR-Strahlung (ca. 980 nm), wodurch dieses Ion in einen langlebigen Übergangszustand angeregt wird. Diese Anregungsenergie wird anschließends equentiell auf die sogenannten Aktivator-Ionen übertragen, oder die Aktivator-Ionen werden direkt angeregt. Abhängig von der Wahl des Aktivator-Ions (z. B. Erbium, Holmium oder Thulium) emittieren die UCNPs sichtbares Licht unterschiedlicher Wellenlängen. Durch eine Dotierung mit Erbium wird die Emission von grünem und rotem Licht erzielt (Abb. 1B). Holmium-dotierte UCNPs weisen ähnliche Emissionsbanden auf, wohingegen Thulium-dotierte Partikel im blauen und rotem Wellenlängenbereich emittieren [1].

Durch die Anregung mit NIR-Licht sind praktisch Hintergrund-freie Messungen möglich. Diesen Effekt macht man sich auch bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie zunutze, allerdings lassen sich die UCNPs unter wesentlich milderen Bedingungen anregen, sodass auf teure gepulste Laser verzichtet werden kann. Die Verwendung dieser Nanopartikel bietet eine Reihe von weiteren Vorteilen: (a) NIR-Strahlung dringt relativ tief (bis zu 5 mm) in biologisches Gewebe ein, wodurch eine Untersuchung von ganzen Geweben oder kleinen Tieren möglich ist [2]; (b) Sie weisen im Gegensatz zu organischen Fluorophoren und Quantenpunkten mehrere schmale Emissionsbanden auf, die sich spektral gut vom Anregungslicht trennen lassen; (c) Sie werden anders als organische Fluorophore selbst bei längerer oder häufiger Anregung nicht durch das Anregungslicht zerstört (kein Photobleichen), sodass sie für Langzeitstudien geeignet sind; (d) Schließlich enthalten diese Nanopartikel im Gegensatz zu Quantenpunkten keine zytotoxischen Schwermetalle [3].

Oberflächenfunktionalisierung von UCNPs
Bevor UCNPs für biologische oder medizinische Anwendungen einsetzbar sind, muss ihre Oberfläche möglichst einfach, reproduzierbar und schnell funktionalisierbar sein. Die Nanopartikel lassen sich am effizientesten in organischen Lösungsmitteln synthetisieren. Daher ist ihre Oberfläche häufig mit hydrophoben Liganden, wie z. B. Ölsäure, bedeckt. In wässrigen Systemen bilden sie jedoch nur dann stabile Dispersionen, wenn sie eine hydrophile Oberfläche besitzen. Eine Umwandlung der Oberflächeneigenschaften nach der Synthese kann entweder durch Ligandenaustausch der Ölsäure gegen hydrophile Oberflächenliganden oder durch Oxidation der Ölsäure erreicht werden (Abb.2A). Da die Liganden von der Partikeloberfläche dissoziieren können, sind solche Dispersionen jedoch nicht über längere Zeit stabil und es kommt leicht zur Aggregation der Partikel. Eine stabilere Art der Funktionalisierung, bietet die Umhüllung mit einer Schicht aus hydrophilem Siliziumdioxid, an dessen Oberfläche je nach Bedarf unterschiedliche funktionelle Gruppen angebunden werden können (Abb. 2B). Das Spektrum an funktionellen Gruppen für die kovalente Anheftung von Biomolekülen ist recht breit gefächert. Eine der gängigsten Methoden ist die Funktionalisierung der Oberfläche mit Carboxylatgruppen, die alleine jedoch äußerst reaktionsträge sind. Erst die Aktivierung der Carboxylatgruppen durch Bildung eines Succinimidesters ermöglicht die anschließende kovalente Kopplung an Aminogruppen z.B. von Proteinen [4] oder anderen Biomolekülen. Die gleiche Modifikation ist auch mit inverser Funktionalität möglich, d.h. bei einer Anbindung von Amin-funktionalisierten Nanopartikeln an Proteine über eine Carboxylatgruppe. Eine weitere Möglichkeit, um Proteine an die Oberfläche zu binden, besteht in der Oberflächenfunktionalisierung mit Maleimid. Diese funktionelle Gruppe bindet kovalentan die Thiolgruppen von Proteinen, die von den Seitenketten der Aminosäure Cystein bereitgestellt werden [5].

Darüber hinaus kann die Oberfläche mit sogenannten bioorthogonalen Gruppen modifiziert werden. Diese Gruppen spielen in biologischen Prozessen keine Rolle und erlauben deshalb eine gezielte Kopplungsreaktion ohne unerwünschte Nebenreaktionen wie zum Beispiel Wechselwirkungen mit Biomolekülen oder Beeinträchtigungen von biochemischen Prozessen [6]. Organische Azide und Alkine sind bioorthogonale Gruppen, die sich durch die Kupfer(I)-katalysierte 1,3-dipolare Cycloaddition (Huisgen-Reaktion) verknüpfen lassen. Diese Kopplung ist eine der am weitesten verwendete Form der Click-Chemie. Wenn UCNPs mit einer Azid- beziehungsweise Alkingruppe modifiziert werden, können diese Partikel nach einem Bausteinprinzip weiter funktionalisiert werden [7]. Diese „Bausteine" können einfache Moleküle sein, die die komplementäre funktionelle Gruppe tragen, aber auch verschiedene Biomoleküle wie Antikörper, Proteine oder Oligonukleotide. Dadurch können sie schnell, einfach und unter immer gleichen Reaktionsbedingungen für ihre jeweilige bioanalytische Anwendung angepasst werden.

UCNPs in der Bioanalytik und Medizin
UCNPs wurden bereits erfolgreich mit Biomolekülen wie Proteine oder kurze Oligonukleotidsequenzen funktionalisiert. Die Modifikation mit Antikörpern ist wichtig für verschiedene biologische oder medizinische Anwendungen, wie zum Beispiel Immunoassays für den Nachweis von Antigenen oder Pathogenen. Homogene Immunoassays, bei denen alle Reaktionsschritte in Lösung erfolgen, lassen sich durch Verwendung des sogenannten Aufkonvertierung-Fluoreszenzenergietransfer (kurz: engl. UC-FRET) durchführen. Hierbei fungieren die Nanopartikel als Donoren, deren Emissionslicht von organischen Fluorophoren gelöscht wird, sobald der Analyt vom Antikörper auf dem UCNP gebunden wird [8]. Mit Antikörpern modifiziert eignen sie sich außerdem zur Markierung und Bildgebung von Zellstrukturen. Weil NIR-Licht nur geringfügig von biologischen Materialien absorbiert wird, ist sogar die Darstellung von vollständigen Gewebestrukturen möglich, wobei eine gute Unterscheidung vom Hintergrund bzw. von nicht markierten Strukturen gewährleistet ist [9]. Eine Mehrfach- bzw. Multiplex-Markierung wird erreicht [10], indem man die Intensität einer Emissionsbande gezielt durch die Beschichtung der Nanopartikel mit einem organischen Farbstoff einstellt, während eine weitere Bande als konstanter Referenzwert dient [11] (Abb. 3). Aus dem Verhältnis der Intensitäten beider Emissionsbanden ergibt sich ein „ratiometrischer Wert", der unabhängig von Schwankungen in der Intensität des Anregungslichts oder der Sensitivität der Kamera ist. Durch Verwendung unterschiedlicher Farbstoffkonzentrationen können UCNPs synthetisiert werden, die sich anhand ihres Emissionsmusters identifizieren lassen. Außerdem können sie auch als Nanothermometer eingesetzt werden, da die Intensität ihrer Emissionsbanden stark von der Temperatur abhängt [12]. Diese Temperaturabhängigkeit der einzelnen Emissionsbanden ist verschieden stark ausgeprägt, so dass diese für eine ratiometrische Temperaturbestimmung einsetzbar sind.

Bevor das Potential dieser Partikel voll ausgeschöpft werden kann, gilt es noch einige Hürden zu überwinden. So ist die kommerzielle Verfügbarkeit von monodispersen und stabilen UCNPs begrenzt und es sind noch keine Messgeräte mit eingebauter NIR-Anregung auf dem Markt erhältlich. Wenn diese Probleme erst einmal beseitigt sind, steht einer weiteren Verbreitung dieser neuen optischen Markierung in biologischen und medizinischen Anwendungen nichts mehr im Wege.

Danksagung
Wir danken Dr. Stefan Wilhelm für die Synthese von UCNPs und die elektronenmikroskopische Aufnahme in Abb. 1A.

Literatur ist unter: http://bit.ly/Gorris-Referenzen erhältlich.

 

Autor(en)

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Universität Regensburg- Institut für Analyt. Chemie, Chemo- und Biosensorik
Universitätsstr. 31
93053 Regensburg
Deutschland

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