Biopharmazeutisch hergestellte Arzneimittel stellen einen ernstzunehmenden und wachsenden Faktor in der medizinischen Behandlung diverser Krankheitsbilder dar. Mehr als 130 protein- oder peptidbasierte Präparate sind zurzeit durch die FDA (Food and Drug Administration) zugelassen und finden bereits ihre routinemäßige Anwendung in der klinischen Praxis. Viele Behandlungsmethoden wurden dabei durch die medizinische und molekularbiologische Grundlagenforschung ermöglicht, welche z.B. Mutationen von körpereigenen Proteinen, deren reduzierte Expressionsraten oder vollkommene Defizienz als Krankheitsursache feststellen konnten. Ohne eine absehbare Möglichkeit der Gentherapie sind Substitutionstherapien die Methode der Wahl, um die Symptome zu mildern. So kann z.B. bei der Gerinnungsstörung Haemophilie B das Fehlen von Koagulationsfaktor IX durch die prophylaktische, intravenöse Verabreichung von aufgereinigten Faktor IX-Präparaten abgemildert werden.

Therapeutische Proteinpräparate werden entweder in aufwendigen Prozessen aus humanem Material (meist Serumspenden) aufgereinigt oder rekombinant in geeigneten Organismen exprimiert. In beiden Fällen muss das Produkt anschließend einen aufwendigen biochemischen Charakterisierungsprozess durchlaufen, der Parameter wie Aktivität, Struktur oder Reinheit sicherstellt.

Im Gegensatz zu niedermolekularen Wirkstoffen stellen Proteine jedoch sehr komplexe Moleküle dar, die vielfältigen Veränderungen und Modifikationen unterworfen werden können. Neben der reinen Proteinsequenz sind z.B. humankompatible Zuckermodifikationen (Glykosylierungen) essentiell für korrekte Funktion und ausreichende Stabilität der Proteine im Blutkreislauf. Weiterhin können Verunreinigungen der Präparate durch Beiprodukte zu negativen Reaktionen bei kontinuierlicher Administration führen.

Zur Analyse dieser komplexen Biopharmazeutika können neben den klassischen Methoden der Proteinchemie auch Techniken der derzeitigen Proteomforschung, wie miniaturisierte Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie, verwendet werden. Ein Beispiel einer solchen Analyse ist der Vergleich zweier Koagulationsfaktor IX-Produkte, die entweder rekombinant exprimiert oder aus Humanplasma aufgereinigt wurden.

Dabei stellen sich konkret die Fragen, ob die Produkte sich in ihrer Reinheit unterscheiden, was diesen Unterschied genau ausmacht und ob die Modifikationen der Proteine vergleichbar sind.

Proteintrennung und Identifikation

Die Proteine müssen zunächst über Ultrafiltration, Größenausschlußchromatographie oder geeignete Fällungen von Salzen und Hilfsstoffen wie Aminosäuren und Detergenzien getrennt werden, die für die intravenöse Verabreichung notwendig sind.

Auf Proteinebene kann anschließend eine Separation auf Basis der Proteinmasse (z.B. Gelelektrophorese), der Hydrophobizität (z.B. Umkehrphasenchromatographie) oder auch der Ladung (z.B. Kationenaustauschchromatographie) erfolgen. In Abbildung 1 wird exemplarisch die Trennung über 1D-SDS Gelelektrophorese (PAGE) der miniaturisierten Umkehrphasenchromatographie auf monolitischen HPLC-Säulen (Dionex) gegenübergestellt. Es ist leicht ersichtlich, dass Produkt 1 eine Vielzahl von zusätzlichen Banden bzw. Peaks aufweist, die es von Produkt 2 unterscheiden. Monolithische Trennsysteme bieten hier den Vorteil der einfachen Automatisierbarkeit bei guter Reproduzierbarkeit, während die 1D-SDS-Gelelektrophorese durchgängig in fast jedem Labor verfügbar ist und durch kommerzielle Komponenten wie Fertiggele ebenfalls reproduzierbar ist. Beide Verfahren ermöglichen eine relative Quantifizierung der Verunreinigungen durch Peakflächen- (UV) oder Bildvergleiche, z.B. über ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Im vorliegenden Fall ist das Produkt 1 zu ~57% (UV-Absorption) durch andere Proteine verunreinigt.

Um die genaue Zusammensetzung der Kontaminationen zu bestimmen, kann die massenspektrometrische Sequenzierung von Proteinen verwendet werden. Diese basiert auf dem Vergleich von experimentellen Messspektren mit den Proteinsequenzen in allgemeinen Datenbanken wie der Swiss-Prot (www.uniprot.org). Im Allgemeinen werden dazu die Proteine zunächst unter definierten Bedingungen proteolysiert. Bei der gängigen Verwendung von Trypsin als Protease und Spaltung an Lysinen und Argininen entstehen so nach der Ionisation durch Elektrospray überwiegend Peptide mit einem Masse/Ladungsverhältnis (m/z) von 600-3000. Aus den intakten Peptidmassen lässt sich jedoch noch keine Peptidsequenz ableiten - deshalb werden einzelne Peptidsignale im Massenspektrometer isoliert und anschließend durch Energieübertrag zur Fragmentierung angeregt. Dies führt zur Bildung einer Vielzahl von Bindungsbrüchen zwischen einzelnen Aminosäuren - und damit zu einem Fragmen-tionenspektrum mit gegenläufigen Ionenserien (siehe Abb. 2 f). Die Massendifferenz zwischen zwei benachbarten Signalen einer Serie entspricht dabei einer Aminosäuremasse. Durch den automatisierten Vergleich von experimentellen Peptidspektren und annotierten Datenbanken - z.B. über Suchalgorithmen wie Mascot, Sequest, Omssa usw. - können so Proteine bereits anhand eines einzigen Peptides identifiziert werden. Im vorliegenden Fall der Koagulationsfaktoren würden dabei zwei Strategien verfolgt: Zum einen wurden die Proteine der jeweiligen Präparate in Lösung verdaut, zum anderen wurden Banden aus 1D-Gelen wie in Abbildung 1 ausgeschnitten, die Proteine direkt im Gel proteolysiert und anschließend die Peptide extrahiert. Die resultierenden Peptidmischungen wurden über miniaturisierte nanoLC-Systeme auf Umkehrchromatographiebasis getrennt, um die Komplexität der Proben vor dem Eintritt ins Massenspektrometer zu reduzieren. Die dazu verwendeten Trennsäulen besitzen lediglich 75 µm Innendurchmesser und sind in Abb. 2 c dargestellt. Aus den in-Gel Verdauen lässt sich auf die Identität einzelner Proteine in den jeweiligen Banden schließen - im vorliegenden Fall („*" in Abbildung 1 c) Antithrombin III sowie Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 1 und 2 für Produkt 1. Da jedoch nicht alle Proteinsequenzen gleich effizient mit Trypsin geschnitten werden können, wurden für die in-Lösungsverdaue zusätzlich parallel Pepsin, ArgC und Chymotrypsin verwendet. Dadurch konnten insgesamt 46 Proteine für Produkt 1 identifiziert werden. Für Produkt 2 hingegen konnten keine weiteren Proteine gefunden werden - weder humane Proteine noch evtl. kontaminierende Proteine aus dem Produktionsorganismus.