Entwicklung von therapeutischen Antikörpern im Reagenzglas

Nutzung des Antikörperphagendisplay

  • Abb. 1: Antikörper-Phagendisplay. a) Der Antikörper-Phagenpartikel ermöglicht die physische Kopplung von Gen (Antikörper) und Funktion (Antigenbindung) und damit die Selektion beliebiger monoklonaler menschlicher Antikörper komplett im Reagenzglas. b) Panning mit löslichem Kompetitor zur Abreicherung von Antikörpern Kreuzreaktionen. c) Panning unter besonderen biochemischen Bedingungen selektioniert nur Antikörper, die unter diesen Bedingungen aktiv sind. d) Sequentielles Panning erzeugt Antikörper, die an ein gemeinsames strukturelles Merkmal verschiedener Proteine binden. Abb. 1: Antikörper-Phagendisplay. a) Der Antikörper-Phagenpartikel ermöglicht die physische Kopplung von Gen (Antikörper) und Funktion (Antigenbindung) und damit die Selektion beliebiger monoklonaler menschlicher Antikörper komplett im Reagenzglas. b) Panning mit löslichem Kompetitor zur Abreicherung von Antikörpern Kreuzreaktionen. c) Panning unter besonderen biochemischen Bedingungen selektioniert nur Antikörper, die unter diesen Bedingungen aktiv sind. d) Sequentielles Panning erzeugt Antikörper, die an ein gemeinsames strukturelles Merkmal verschiedener Proteine binden.
  • Abb. 1: Antikörper-Phagendisplay. a) Der Antikörper-Phagenpartikel ermöglicht die physische Kopplung von Gen (Antikörper) und Funktion (Antigenbindung) und damit die Selektion beliebiger monoklonaler menschlicher Antikörper komplett im Reagenzglas. b) Panning mit löslichem Kompetitor zur Abreicherung von Antikörpern Kreuzreaktionen. c) Panning unter besonderen biochemischen Bedingungen selektioniert nur Antikörper, die unter diesen Bedingungen aktiv sind. d) Sequentielles Panning erzeugt Antikörper, die an ein gemeinsames strukturelles Merkmal verschiedener Proteine binden.
  • Tab. 1: Zugelassene therapeutische Antikörper aus dem Phagendisplay
André Frenzel1,2, Thomas Schirrmann1, Stefan Dübel1, Michael Hust2
 
Monoklonale Antikörper sind mittlerweile die größte und am schnellsten wachsende Gruppe therapeutischer Proteine (“biologicals”). Aktuell sind über 50 Antikörpermedikamente für die klinische Verwendung zugelassen, und generierten 2013 einen Umsatz von 75 Milliarden $ [1]. Mehr als 500 Antikörpermedikamente befinden sich zurzeit in der klinischen Erprobung, meist gegen Krebs und Autoimmunerkrankungen. Der erste zugelassene Antikörper war ein mittels der Hybridom-Technologie gewonnener Maus-Antikörper [2]. Murine Antikörper werden jedoch vom Menschen als fremd erkannt und induzieren eine unerwünschte Immunreaktion [3]. Deshalb wurden die murinen Anteile durch rekombiante DNA-Technologie mehr und mehr reduziert. So entstanden chimäre (murine konstante Domänen durch humane ersetzt) oder humanisierte Antikörper (antigenbindende Loops in humane Antikörper eingesetzt) [4, 5]. Heute werden allerdings bevorzugt komplett humane Antikörper eingesetzt. Diese werden zum einen mithilfe von Hybridomtechnologie aus immunisierten transgenen Mäuse oder Ratten gewonnen, welche menschliche Immunglobulinloci besitzen [6–8].
 
Herstellung von Antikörpern im Reagenzglas
 
Einen Weg zur Generierung von Antikörpern komplett im Reagenzglas, bietet das Antikörperphagendisplay. Aufbauend auf der Arbeit von G.P. Smith an filamentösen Phagen wurde das Antikörperphagendisplay in Heidelberg von Breitling und Dübel [10], in Cambridge von McCafferty et al. [11] und in LaJolla von Barbas et al. [12] unabhängig entwickelt. Dabei werden die antigenbindenden Teile der Antikörper, entweder das Fab (fragment antigen binding) [13, 14] oder das scFv (single chain fragment variable) [15–17] an das Oberflächenprotein III (pIII) der M13-Phagen fusioniert und so auf deren Oberfläche präsentiert. Im Phagen selbst ist dabei die genetische Information für den präsentierten Antikörper kodiert - so entsteht die Verknüpfung von Genotyp und Phänotyp.

Aus einem Gemisch („Bibliothek“) von Phagen mit unterschiedlichen Antikörpern können durch Affinitätsanreicherung am Antigen in vitro die Gene für jene Antikörper selektiert werden, die an das Antigen binden („panning“, Fig. 1a). Die Antikörperfragmente werden dabei in der Regel auf einem separaten Plasmid kodiert, welches in Phagen verpackt wird („Phagemid“) [10]. Beim Antikörper-Phagen-Display werden viele Einschränkungen des Immunsystems umgangen, so können auch Antikörper gegen nicht immunogene Moleküle [18] generiert werden. Ein besonderer Vorteil ist die Möglichkeit, die biochemischen Parameter bei der Selektion komplett zu kontrollieren. Während des eigentlichen Selektionsschrittes, also der Affinitätsselektion der Antikörperphagen auf dem Antigen, kann z. B. mit einem löslichen Kompetitor eine unerwünschte Kreuzreaktvität von vorneherein ausgeschlossen werden (Fig, 1b). So können Antikörper selektiert werden, die spezifisch für eine geringe Modifikation des Antigens [19] oder eine spezifische Konformation [20] sind. Auch kann der Puffer bereits bei der Selektion genau auf die Bediungungen der späteren Anwendungen eingestellt werden (Fig. 1c). Andererseits erbringen aufeinanderfolgende Affinitätsanreicherungs-Schritte (pannings) auf homologen Proteinen nur solche Antikörper, die an die Gemeinsamkeiten der beiden Proteine binden (Fig. 1d). Dies ist bei der Entwicklung therapeutischer Antikörper besonders interessant, da eine gleichzeitige Wirkung im Menschen wie in einem geeigneten Tiermodell die Entwicklung stark vereinfacht. Da die genetische Information sofort vorliegt, kann nachfolgend der Antikörper nach Bedarf in anderen Formaten, z. B als IgG (21, 22), oder als scFv-Fc-Fusion mit wählbaren Fc-Teil von verschiedenen Spezies [23] produziert werden.

 
Nutzung von Antikörper-Genbibliotheken
 
Voraussetzung für das Phagendisplay sind sehr große Antikörper-Genbibliotheken, für deren Herstellung es verschiedene Möglichkeiten gibt. Immunbibliotheken aus B-Zellen von immunisierten Spendern [24] sind besonders geeignet, um in vivo affinitätsgereifte Antikörper gegen jenes Antigen zu selektieren, gegen das die Spender bereits eine Immunreaktion entwickelten. Immunbiblioteken enthalten typischerweise mehr als eine Million verschiedener Antikörpersequenzen. Aus universellen Bibliotheken können dagegen Antikörper gegen jede Art von Antigen gewonnen werden, sie müssen deshalb um einige Größenordnungen diverser sein. Gute universelle Bibliotheken enthalten typischerweise mehr als zehn Milliarden verschiedener Antikörperklone [25]. Es gibt verschiedene Wege zur Herstellung des sehr umfangreichen Genrepertoires für Antikörper-Phagendisplay-Bibliotheken. Synthetische universelle Bibliotheken basieren auf Gerüstregionen der variablen Domänen, in welche komplett synthetische randomisierte CDR (complementary determining regions) eingesetzt wurden [15]. Bei semi-synthetischen Bibliotheken werden typischerweise gut produzierbare variable Regionen der schweren und leichten Kette genutzt, um randomisierte synthetische CDRs einzubauen, meist jedoch nur der CDR3 der schweren Kette [26]. Bei den naiven universellen Bibliotheken wird das naive IgM Antikörpergenrepertoire von B-Zellen zahlreicher Spender ohne zusätzliche Mutationen kloniert, dies gewährleistet, dass diese Antikörpersequenzen eine minimale Zahl von Mutationen gegenüber den Keimbahn-Genen aufweisen. [25]. Der Vorteil ist, dass hier alle variablen Antikörperdomänen schon einmal im Menschen exprimiert wurden und dort der Toleranzselektion unterworfen waren. Dies minimiert das Risiko späterer Immunreaktionen gegen den Antikörper, welche unerwünschte Nebenwirkungen oder sogar Inaktivierung der Wirkung des Antikörpers im Patienten bewirken kann. Aus diesen Gründen werden naive Bibliotheken in unseren Laboren am häufigsten eingesetzt.
 
Der erste zugelassene therapeutische Antikörper aus dem Phagendisplay war adalimumab (Humira). Dieser Antikörper wird gegen rheumatoide Arthritis eingesetzt und bindet den Tumornekrosefaktor (27). Er ist heute das umsatzstärkste therapeutische Protein (biological) [1]. Neben adalimumab wurden bisher fünf weitere Phagendisplay-Antikörper zugelassen (Tab.1). Aktuell sind weiterhin mehr als sechzig Phagendisplay-Antikörper in der klinischen Testung (detaillierter Überblick bei Frenzel) [28].
 
Zugehörigkeiten
1Yumab GmbH, Braunschweig
2Technische Universität Braunschweig, Abt. Biotechnologie, Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Braunschweig
 
Kontakt
Prof. Dr. Michael Hust
Technische Universität Braunschweig
Abt. Biotechnologie
Institut für Biochemie, 
Biotechnologie und Bioinformatik
Braunschweig
m.hust@tu-bs.de
 
Mehr zu Pharma & Drug Discovery: http://www.git-labor.de/forschung/pharma-und-drug-discovery
 
Monoklonale Antikörper in der Krebstherapie: https://www.krebsinformationsdienst.de/behandlung/monoklonale-antikoerper.php
 

Literatur
1. D.M. Ecker et al. MAbs. 7, 9–14 (2015)
2. C. Emmons, L. G. Hunsicker, Iowa Med. 77, 78–82 (1987)
3. J.A. Kimball et al., Transplant. Proc. 25, 558–560 (1993)
4. W.Y.K. Hwang, J. Foote, Methods. 36, 3–10 (2005)
5. L.G. Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 640–656 (2006)
6. D.M. Fishwild et al., Nat. Biotechnol. 14, 845–51 (1996)
7. A. Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol. 6, 561–6 (1995).
8. M.J. Osborn et al., J. Immunol. 190, 1481–0 (2013)
9. G.P. Smith, Science. 228, 1315–7 (1985)
10. F. Breitling, et al. Gene. 104, 147–53 (1991)
11. J. McCafferty, et al. Nature. 348, 552–4 (1990)
12. C.F. Barbas, et al.  PNAS 88, 7978–82 (1991)
13. R.M. Hoet et al., Nat. Biotechnol. 23, 344–8 (2005)
14. T. Tiller et al., MAbs. 5, 445–70 (2013)
15. D.J. Schofield et al., Genome Biol. 8, R254 (2007)
16. T.J. Vaughan et al., Nat. Biotechnol. 14, 309–14 (1996)
17. M. Hust et al., J. Biotechnol. 152, 159–70 (2011)
18. A. Moghaddam et al., J. Immunol. Methods. 280, 139–55 (2003)
19. A. Blokzijl et al., Mol. Cell Proteomics. 15, 1848–56 (2016)
20. C. Nizak et al., Science. 300, 984–87 (2003)
21. T. Jostock et al., J. Immunol. Methods. 289, 65–80 (2004)
22. M. Steinwand et al., MAbs. 6, 204–18 (2014)
23. V. Jäger et al,  BMC Biotechnol. 13:52 (2013)
24. M. Trott et al., PLoS ONE. 9, e97478 (2014)
25. J. Kügler et al., BMC Biotechnol. 15, 10 (2015)
26. A. Pini et al., J. Biol. Chem. 273, 21769–76 (1998)
27. J. Osbourn, et al. Methods. 36, 61–8 (2005)
28. A. Frenzel et al., MAbs. 8, 1177–94 (2016)
 

 

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.