Hochdurchsatz-Screening

Vom Siegeszug biologisch aussagekräftiger Assays in der Pharmaforschung

  • Abb. 1: Das CRISPR/CAS System zur RNA-geleiteten Genomeditierung ermöglicht die gerichtete Manipulation von Genen zur Herstellung stabiler Zelllinien für das Hochdurchsatz-Screening.Abb. 1: Das CRISPR/CAS System zur RNA-geleiteten Genomeditierung ermöglicht die gerichtete Manipulation von Genen zur Herstellung stabiler Zelllinien für das Hochdurchsatz-Screening.
  • Abb. 1: Das CRISPR/CAS System zur RNA-geleiteten Genomeditierung ermöglicht die gerichtete Manipulation von Genen zur Herstellung stabiler Zelllinien für das Hochdurchsatz-Screening.
  • Abb. 2: Beispiel für an neurodegenerativen Erkrankungen beteiligte Zelltypen und ihre Herstellung für das High-Content-Screening.
  • Abb. 3: Die 3D-Zellkultur simuliert die natürliche Umgebung der Zelle mit strukturierter Einbettung in die extrazelluläre Matrix und vielfältigen Kontakten zu Nachbarzellen.
  • Abb. 4: Schema einer Zebrafisch-Screenignkampagne. Erwachsene Tiere mit fluoreszenzmarkierten zu analysierenden Genen werden gekreuzt, die jungen Larven werden in Screening-Platten ausgelegt. 48 h nach Substanzzugabe werden Phänotyp und allgemeiner Gesundheitszustand der Tiere über bildgebende Verfahren ausgewertet.

Screening: Fast jeder Review zum Thema Wirkstoffentwicklung beginnt mittlerweile mit dem Hinweis auf die sinkenden Erfolgsquoten bei der klinischen Entwicklung neuer Wirkstoffkandidaten, welche die pharmazeutische Industrie zum Handeln zwingen. Für einfacher zu behandelnde Krankheiten ist eine Vielzahl zugelassener Wirkstoffe verfügbar; für die erfolgreiche therapeutische Erschließung bislang nicht behandelbarer Krankheiten werden neue, biologisch relevante Assay-Technologien benötigt.

Pharmazeutische Unternehmen sind genötigt, den Prozess des Screenings und der Wirkstoffentwicklung neu aufzustellen, um die schlechtesten Wirkstoffkandidaten so früh wie möglich aus der Entwicklungs-Pipeline zu entfernen. In diesem Artikel wird eine Übersicht über neuartige Assay-Systeme mit hoher biologischer Vorhersagekraft beschrieben, mit denen die präklinische Phase der Wirkstoffentwicklung effizienter gestaltet werden und so die Anzahl der Wirkstoffe, die die Marktzulassung erreichen, erhöht werden kann.

Die Überführung des stetig wachsenden Verständnisses von krankheitsrelevanten biologischen Mechanismen in aussagekräftige biologische Assay-Systeme bietet die Möglichkeit, Wirkstoffe für bislang nur schwer adressierbare Krankheiten zu entwickeln. Neue Ansätze wie „Omics"-Technologien und Methoden wie die gerichtete Nuklease-vermittelte Genom-Editierung haben das Target- und Assay-Portfolio um eine Vielzahl neuer Ansätze bereichert, bei deren Umsetzung frühzeitig auf biologische Relevanz geachtet wird.

Enzymatische Assays
In manchen Fällen ist bereits die vergleichsweise einfache Wahl eines biologisch relevanten Enzym-Substrats entscheidend für den nachhaltigen Erfolg eines Projektes. Ein prominentes Beispiel hierfür liefern die von der Firma Sirtris entwickelten Aktivatoren der Histon-Deacetylase Sirt1, welche die Behandlung von Diabetes revolutionieren, und sogar die Lebensdauer ganzer Organismen verlängern sollten. Ursprünglich in einem biochemischen Assay mit einem fluoreszenzbasierten Substrat identifiziert, wurden die Inhibitoren zusammen mit der Firma Sirtris auf dem Höhepunkt Ihres Hypes für die Rekordsumme von 720 Millionen US-$ von der Firma GSK übernommen.

Später wurde von unabhängiger Seite nachgewiesen, dass sich die aktivierende Wirkung der Substanzen auf das artifizielle, fluoreszenzbasierte Substrat beschränkt. Die Firma Sirtris wurde mittlerweile aufgelöst.

Ein weiteres Beispiel aus dem Umfeld des Autors für die Bedeutung der Substratwahl ist ein Assay zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms Rab-Geranylgeranyl-Transferase (Rab GGTase). Zunächst wurde ein biochemischer Rab GGTase-Assay entwickelt, welcher auf dem Transfer eines artifiziellen, fluoreszenzmarkierten Gernalylgeranyl-Derivates beruhte. Dieser Assay erwies sich jedoch als nicht prädiktiv für die Aktivität der Inhibitoren im zellulären System; letzteres kam wegen des niedrigen Durchsatzes für eine Primär-Screening-Kampagne nicht in Frage. Der Wechsel auf ein radioaktives Assay-Format erlaubte die Verwendung eines Isotopen-markierten, chemisch naturidentischen Geranlygeranyl-Substrates. Nachdem die Vorhersagekraft dieses Assays für die zelluläre Rab GGTase-Aktivität validiert worden war, wurde der radioaktive Assay erfolgreich für eine Screening-Kampagne eingesetzt.

Obwohl in den letzten Jahren radiometrische Standard-Assays in vielen Fällen durch einfacher handzuhabende fluoreszenzbasierte Technologien ersetzt worden sind, gewinnen radiometrische Assays bei weniger charakterisierten Enzymen, oder bei komplexeren, biologisch relevanteren Assays wieder an Bedeutung.

Eine weitere Technologie, welche die Verwendung von endogenen Substraten im Primär-Screening ermöglicht, ist die Massenspektrometrie. Mittlerweile wurde die Massenspektrometrie hinsichtlich Probenaufbereitung, Chromatographie, Empfindlichkeit und Datenanalyse so weit optimiert, dass Hochdurchsatz-Massenspektrometrie für das Screening ganzer Substanzbibliotheken eingesetzt werden kann. Vorgeschaltete Systeme wie das Rapidfire-Chromatographiesystem von Agilent können je nach Bedarf mit verschiedenen Massenspektrometern wie QQQ, TOF oder QTOF, kombiniert werden, um den Umsatz von nativen Substraten zu verfolgen, wobei sogar zwischen mehreren Modifikationen der Substrate unterschieden werden kann. Weniger Probenvorbereitung als das Rapidfire-System, jedoch einen erhöhten Aufwand bei der Assay-Entwicklung erfordert die Kombination aus Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionization (MALDI) und QQQ, bei der extrem hohe Probendurchsätze erzielt werden können. Massenspektrometrische Hochdurchsatz-Methoden erfordern einen hohen Grad der Spezialisierung und sind in Anschaffung und Unterhalt kostenintensiv, dieses Feld entwickelt sich jedoch rasch weiter.

Zelluläre Assays
Ein höherer Level der biologischen Relevanz kann mit zellulären Assays erreicht werden, entweder auf Ebene der individuellen Zelle, oder im Zellverbund. Klassische immortalisierte Zelllinien oder Tumorzelllinien, welche traditionell in vielen zellulären Assays eingesetzt werden, sind jedoch nach jahrzehntelanger Passage in Zellkultur oft stark an die artifiziellen in vitro Bedingungen angepasst; ihre Genome sind stark verändert, oder sogar instabil.

Klassische GPCR (G-Protein gekoppelte Rezeptor)-Assays wie Ligandenbindung, cAMP Reporter oder die Messung des GPCR-induzierten Kalziumflusses werde mit moderneren Assays komplementiert, welche unterscheiden können zwischen verschiedenen Downstream-Signalwegen, dem sogenannten „Biased signaling", oder mit Marker-freien Assay-Systemen, die die Untersuchung von endogenen GPCRs ermöglichen, wie Elektroden zur Impedanzmessung, oder optische Biosensoren.

Neue Methoden der Manipulation von Zellen auf genomischer Ebene wie TALENs (Transcription activator-like effector nucleases), Zink-Finger Nukleasen, oder CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) /CAS erweitern die Rahmenbedingungen von zellulären Assays. Diese Methoden zu DNA- oder RNA-geleiteten nukleasevermittelten Genomeditierung ermöglichen die schnelle und einfache Veränderung von Genen in einer Vielzahl biomedizinisch wichtiger Zelltypen (und in ganzen Organismen). Mithilfe von gezielter Genomeditierung können z.B. genetisch gleichartige Zelllinien, die sich in nur in einem einzigen Gen unterscheiden, stabil hergestellt werden. So können hochstandardisierte Zellmodelle für das Hochdurchsatz-Screening erzeugt werden, wie z.B. Zelllinien, welche krankheitsrelevante Mutationen enthalten, oder Reporterzelllinien, mit der die Induktion von Genen in Ihrem natürlichen chromosomalen Kontext untersucht werden kann.

Das sogenannte High-Content-Screening (HCS) kombiniert moderne Methoden der Multiparametrischen Analyse mit den Methoden des Hochdurchsatz-Screenings. Anders als traditionelle Methoden des Hochdurchsatz-Screenings, die auf die Analyse von isolierten, molekularen Ereignissen oder einzelnen Zelleigenschaften beschränkt sind, erlaubt HCS die quantitative Analyse multiparametrischer Daten in komplexen biologischen Systemen. In der Regel kommen beim HCS bildgebende Verfahren zum Einsatz. HCS ist eine Art des phänotypischen Screenings in Zellen. Die phänotypischen Analysen können z.B. Änderung in der intrazellulären Lokalisierung eines Proteins innerhalb der Zellen, oder die Änderung subzellulärer Strukturen sein. Das High Content Screening ermöglicht die Nachbildung komplexer Systeme aus verschiedenen Zellentypen, einschließlich der die Zellen im Organismus umgebenden extrazellulären Matrix. Gerade bei der Entwicklung von Therapien für neurodegenerative Erkrankungen wird verstärkt über HCS mit komplexen Modellen aus verschiedenen Zelltypen gescreent, da die zellulären Prozesse, welche für den Krankheitsverlauf entscheidend sind, immer besser verstanden werden, wohingegen mit Inhibitoren einzelner molekularer Targets bislang keine Fortschritte bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen erzielt werden konnten.

Der Begriff HCS bezieht sich auf jeden Assay, bei dem ganze Zellen oder Zellkomplexe über das parallele Auslesen mehrerer Parameter analysiert werden. Neben mikroskopischen Methoden kommt in jüngster Zeit eine weitere Art des High Content Screenings verstärkt zum Einsatz, die Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie, bei der durch Kombinationen mehrerer Innovationen um das Durchflusszytometer, wie z.B. Probennahme und automatisierte Analysetechniken, ein sehr hoher Durchsatz erreicht wird.

In der herkömmlichen Zellkultur breiten sich adhärente Zellen auf einer Plastik- oder Glasunterlage als einzellige Schicht aus. Sie wachsen zu einem dichten Zellrasen heran, stellen Ihr Wachstum jedoch ein, sobald sie zu konfluent werden. Im menschlichen Körper wachsen Zellen jedoch dreidimensional, umgeben von der extrazellulären Matrix, eingebettet in Zellverbänden und Organstrukturen. 2D-Zellkulturmodelle imitieren die reale Situation im Gewebe beziehungsweise Organ sehr unzureichend. Ein wesentlicher Schritt in Richtung realitätsgetreue Zellkultur-Modelle, die die in vivo-Situation möglichst genau wiedergeben, sind 3D-Zellkulturen. Bei der 3D-Zellkultur werden Zellen über verschiedene Methoden zum dreidimensionalen Wachstum angeregt, wobei Zell-Zell-Kontakte, die extrazelluläre Matrix, Nährstoff- und Zytokingradienten sowie die strukturierte Ausrichtung der Zellen möglichst naturgetreu nachgebildet werden. Für die Testung von neuen Krebsmedikamenten spielen 3D-Tumormodelle eine immer wichtigere Rolle.

Um die biologische Vorhersagekraft von zellulären Assays zu erhöhen, kann anstelle von etablierten immortalisierten Zelllinien primäres Zellmaterial verwendet werden, oder, wo dies nicht möglich ist, Zellen, deren Eigenschaften denen von humanen krankheitsrelevanten Zellen sehr nahe kommen. Mit dem Siegeszug der induzierten pluripotenten Stammzell(iPS)-Technologie rückt der Einsatz von verschiedensten krankheitsrelevanten Zellen in greifbare Nähe. Pluripotente Stammzellen werden durch künstliche Reprogrammierung von nicht-pluripotenten somatischen Zellen induziert; sie können mithilfe von bestimmten Protokollen in fast beliebige Gewebezellen ausdifferenziert werden. Diese Gewebezellen können dann einzeln oder im Zellverbund in Screening-Kampagnen eingesetzt werden. Die Analyse erfolgt meist über mikroskopische High Content Analyse, um zwischen den einzelnen Zelltypen unterschieden zu können. Anwendungen reichen von Hochdurchsatz-Screening in neuronalen Modellen mit krankheitsrelevanten Mutationen über Safety-Profiling an schlagenden Kardiomyozyten bis zu Toxizitätstestungen in ausdifferenzierten Leberzellen.

Der Einsatz von primärem Zellmaterial in Screening-Kampagnen ist oft durch mangelnde Verfügbarkeit oder Schwierigkeiten bei der Logistik der Probenaufbereitung limitiert. Am weitesten verbreitet ist daher die Verwendung von primären hämatopoetischen Zellen, die aus vergleichsweise leicht verfügbaren Blutproben isoliert werden können.

Screening in ganzen Organismen
Auch wenn zelluläre Assays immer komplexer und prädiktiver werden, so erweisen sich doch viele Substanzklassen, die in zellulären Assays identifiziert werden, in vivo als toxisch oder pharmakologisch inaktiv. Das Screening in lebenden Tieren ist eine Möglichkeit diese Probleme zu umgehen und frühzeitig systemisch toxische Substanzen auszuschließen, und gleichzeitig in vivo aktive Substanzen anzureichern. Als Modellorganismen für das Hochdurchsatz-Screening werden sowohl der Wurm C. Elegans als auch Zebrafisch-Embryonen verwendet. Beide können ökonomisch kultiviert und in Flüssigkeiten dispensiert werden, sodass Screening im Hochdurchsatzformat möglich ist. Zebrafische und C. Elegans zeichnen sich zudem durch ihre optische Transparenz aus, die eine breite Palette von mikroskopischen Analysemethoden erlaubt. Größere Kulturen der Tiere werden zunächst in Ihrer Entwicklung synchronisiert, geerntet, gewaschen und mit einer bestimmten Dichte in Assay-Platten ausplattiert, sehr ähnlich dem Vorgehen bei einem zellulären Screen. Die Analyse erfolgt in der Regel über in vivo-Echtzeit Fluoreszenzaufnahmen. In C. Elegans wird häufig auf Modulatoren von hochkonservierten Signalwegen gescreent. Im Unterschied zum invertebraten C. Elegans entwickeln Zebrafische komplexe Organsysteme und eignen sich für das Screening von komplexeren biologischen Prozessen wie Angiogenese und Krebs, aber auch für zelluläre Ereignisse wie Apoptose.

Auch in späteren Phasen der Wirkstoffentwicklung werden verstärkt biologisch relevante Assays eingesetzt. Phänotypische Assays in komplexen Systemen werden nicht nur beim Primär-Screening eingesetzt, sondern auch im Rahmen der Vorhersage von toxischen Effekten auf Organebene. Klassische Kardiotox-Assays wie Patch Clamp zur Messung der hERG-Aktivität werden ergänzt oder sogar ersetzt durch die Profilierung von Substanzen auf Kulturen von pulsierenden Kardiomyozyten, die über Differenzierung von pluripotenten Stammzellen gewonnen werden. Die so gewonnen Informationen gehen weit über eine einfache hERG-Aktivitätsmessung hinaus. Auch andere organspezifischen Assays wie Lebertoxizität können über High-Content-Analysen auf vielfältige Weisen ausgelesen werden; sogar im Zebrafischmodell können Substanzen auf Lebertoxizität getestet werden.

Die Entwicklung biologisch relevanter Assays erfordert ein tiefgehendes Verständnis der Target-Biologie und der krankheitsrelevanten biologischen Mechanismen, wie sie in hochspezialisierten und gut vernetzten akademischen Labors vorhanden sind. Die Umsetzung eines solchen Assays in ein hochdurchsatzfähiges Screening-Format erfordert dagegen spezielles Know-How und Screening-Ausrüstung, die oft nur in der pharmazeutischen Industrie vorhanden sind. Für die Entwicklung und Durchführung von biologisch relevanten Screening-Kampagnen, insbesondere basierend auf neuen Targetklassen oder krankheitsrelevanten Phänotypen, bieten sich daher Kollaborationen von akademischen und industriellen Labors an.

Um die Wirkstoffforschung effizienter zu gestalten und bislang nicht behandelbare Krankheiten therapeutisch zu erschließen, wird bei der Auswahl von Hochdurchsatz-Assays verstärkt auf biologische Relevanz geachtet. Sowohl für enzymatische als auch für zelluläre Screens werden neue Technologien entwickelt, um krankheitsrelevante Mechanismen und Phänotypen im Labormaßstab so naturgetreu wie möglich nachzubilden. Viele dieser Technologien, oft im Zusammenspiel von Industrie und Akademie entwickelt, werden der Wirkstoffentwicklung in den kommenden Jahren neue Perspektiven eröffnen.

Kontakt
Dr. Jan Eickhoff
Geschäftsführer der Hit Discovery Constance GmbH & Leiter
Assayentwicklung und Screening bei der Lead Discovery Center GmbH
Konstanz
eickhoff@hit-discovery.de

Weitere Beiträge zum Thema: www.laboratory-journal.com/category/tags/screening
Chemgapedia-Lerneinheiten zum High-Troughput-Screening: www.chemgapedia.de

Lebenslauf
Jan Eickhoff leitet die Assayentwicklungs- und Screeningabteilung am Lead Discovery Center in Dortmund (LDC), einer Initiative des Technologie-Transfer-Unternehmens Max-Planck-Innovation zur professionellen Überführung aussichtsreicher Forschungsprojekte in die Entwicklung innovativer Medikamente.

Seine Expertise umfasst die frühe Wirkstoffforschung von der Assayentwicklung über HTS bis zu Substanzlogistik und Laborinformationssystemen. Neben der Etablierung der Screengingabteilung am LDC war Herr Eickhoff am Aufbau des zentralen Compound Management und Screening Centers der Max-Planck Gesellschaft (COMAS) beteiligt. Herr Eickhoff ist zudem als Geschäftsführer der Hit Discovery Constance GmbH tätig, einem internationalen Joint Venture, welches HTS- und Compoundlogistik-Dienstleitungen für die Life Science Industrie und akademische Gruppen anbietet.

 

Autor(en)

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Hit Discovery Constance
Byk-Gulden-Str. 2
78467 Konstanz
Telefon: 0231/97427005

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