PRR (engl. pattern recognition receptors, Mustererkennungsrezeptoren) bilden die erste Verteidigungslinie der angeborenen Immunantwort. Verschiedene Untersuchungen der PRR haben in den letzten Jahren viele neue Erkenntnisse geliefert. Das komplexe Netzwerk der Immunsignalwege hat es jedoch bisher verhindert, einzelne PRR-Kombinationen und deren spezifische Liganden zu untersuchen. Ein am Fraunhofer IGB etabliertes zellbasiertes Testsystem erlaubt nun die unmittelbare und hoch spezifische Aktivitätsbestimmung von einzelnen PRR-Rezeptoren beim Menschen.

Die angeborene Immunantwort ist die erste Verteidigungslinie gegen pathogene Mikroben. PRR-Rezeptoren, wie z. B. TLR (engl. toll-like receptors), Dektine, CD14 und NLR (engl. NOD-like receptors), sind an der frühen Detektion von spezifischen Pathogenen beteiligt. Sie erkennen hoch konservierte und klassenspezifische Moleküle von Bakterien, Viren und Pilzen, die als PAMP (engl. pathogen-associated molecular patterns) bezeichnet werden.

Nach Bindung dieser Pyrogene werden intrazelluläre Entzündungssignalwege ausgelöst, die zu einer Aktivierung von spezifischen Transkriptionsfaktoren wie z. B. NF-κB (engl. nuclear factor kappa-lightchain- enhancer of activated B cells) führen. Diese Faktoren induzieren die Transkription von entzündungsfördernden Zytokinen, die Entzündungskaskaden aktivieren und Fieber verursachen[ 1]. Die am besten charakterisierte PRRKlasse ist die TLR-Familie. Bisher konnten zehn humane TLR beschrieben werden, die sich hinsichtlich des Expressionsmusters, der Ligandenspezifität und der von ihnen induzierten Zielgene voneinander unterscheiden [2].

Material und Methoden

Zur Untersuchung der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen der einzelnen Rezeptoren bzw. Rezeptordimere haben wir einen zellbasierten Assay etabliert. Dazu wurden NIH-3T3-Mausfibroblasten verwendet, die mit einem Reportergen-Plasmid stabil transfiziert worden waren. Das Reportergen codiert die sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP), und die Expression des Reportergens wird von NF-κB über einen entsprechenden Promoter kontrolliert.

Zur Analyse einzelner PRR bzw. spezifischer PRR-Heterodimere wurden die Zellen außerdem mit dem gewünschten PRR oder mit einer PRR-Kombination stabil transfiziert.

Dank des NF-κB-regulierten Promoters ist das Reportergen (SEAP) unmittelbar mit dem TLR-Signalweg verknüpft, und die SEAP-Expression ist von der Bindung von TLR an seinen Liganden und somit von der TLR-Aktivierung abhängig (Abb. 1). In diesem Artikel werden zwei unterschiedliche NIH-3T3-SEAP-Zelllinien beschrieben. Diese wurden mit TLR4/CD14 (Abb. 2) bzw. TLR2/6 (Abb. 3) stabil transfiziert. Die Aktivierung kann problemlos mit bloßem Auge oder photometrisch nachgewiesen werden. Der Assay kann auch in einer 96-Well-Mikrotiterplatte gemäß den GLPEmpfehlungen durchgeführt werden.

Ergebnisse und Diskussion

Unsere Experimente zeigen, dass sich die neuen Sensorzelllinien ideal für die Untersuchung von einzelnen humanen PRR bzw. PRR-Kombinationen eignen. Bei der NIH-3T3-SEAP-Zelllinie wird nämlich eine sehr niedrige Hintergrundaktivität des mit dem Promoter NF-κB verknüpften Reportergens SEAP beobachtet, und die endogene TLR-Aktivität ist sehr niedrig oder abwesend (Abb. 4). Daher werden die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten PRR-Reportergen-Zelllinien nur von den spezifischen Liganden auf hoch spzifische Weise aktiviert (Abb. 2 und 3).

Nach einer nächtlichen Induktion mit einer Probe, die den jeweiligen Liganden enthält, kann der Nachweis mithilfe einer Enzym- Substrat-Reaktion in unter 60 M inuten schnell und einfach erfolgen [3]. Der neue Assay kann in vielen Bereichen zur Anwendung kommen: Er ermöglicht die Detektion von einzelnen Liganden oder Ligandenkombinationen mit isolierten PRR. Auf diese Weise können der Rezeptor und auch der Ligand genau untersucht werden. Eine weitere mögliche Anwendung betrifft das Screening auf neue Agonisten und Antagonisten der Immunrezeptoren, wie z. B. auf TLR-Agonisten/Antagonisten.

Diese werden beispielsweise in der Dermatologie immer häufiger zur Modulation der Immunantwort verwendet. PRR-Rezeptoren spielen unter Umständen eine wichtige Rolle bei der Behandlung von Allergien oder pathologischen Änderungen der Haut wie z. B. bei Schuppenflechte oder atopischem Ekzem. Im Rahmen von Allergien führt die falsche bzw. übermäßige Aktivierung von PRR zu einer Freisetzung von Zytokinen, die mit Gewebeänderungen, vom Juckreiz bis hin zu Gewebeschäden, verbunden sind.

Dieses zellbasierte Testsystem erlaubt das Screening von definierten TLR-Antagonisten, die als Immunsuppressiva in Frage kommen.Der Assay eignet sich außerdem zum Nachweis der pyrogenen Eigenschaften von Medizinprodukten (wie z. B. von chirurgischen Instrumenten, Kathetern, Implantaten) sowie von intravenös verabreichten Arzneimitteln.