Impfung durch Eincremen

Transkutane Immunisierung mittels Nanopartikel

  • Abb. 1: Transfollikulare Impfung (TF). Die TF Immunisierung erlaubt es, Impfstoffantigene zu den Immunzellen in der Umgebung der Haarfollikel zu transportieren ohne dabei die Schutzfunktion der Haut zu zerstören (links abgebildet). Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Einsatz von Nanopartikeln in einem TF Impfstoff in Kombination mit einem Adjuvant zu einer effizienten Stimulation von sowohl antigenspezifischen Antikörper- als auch zellulären Immunantworten führt (rechts abgebildet).Abb. 1: Transfollikulare Impfung (TF). Die TF Immunisierung erlaubt es, Impfstoffantigene zu den Immunzellen in der Umgebung der Haarfollikel zu transportieren ohne dabei die Schutzfunktion der Haut zu zerstören (links abgebildet). Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Einsatz von Nanopartikeln in einem TF Impfstoff in Kombination mit einem Adjuvant zu einer effizienten Stimulation von sowohl antigenspezifischen Antikörper- als auch zellulären Immunantworten führt (rechts abgebildet).
  • Abb. 1: Transfollikulare Impfung (TF). Die TF Immunisierung erlaubt es, Impfstoffantigene zu den Immunzellen in der Umgebung der Haarfollikel zu transportieren ohne dabei die Schutzfunktion der Haut zu zerstören (links abgebildet). Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Einsatz von Nanopartikeln in einem TF Impfstoff in Kombination mit einem Adjuvant zu einer effizienten Stimulation von sowohl antigenspezifischen Antikörper- als auch zellulären Immunantworten führt (rechts abgebildet).
  • Abb. 2: TF Impfung stimuliert antigenspezifische Immunantworten. Dargestellt sind der antigenspezifische Antikörpertiter als Endpunktverdünnung (e.p.d. in grün), d. h. die letzte Verdünnung, die den doppelten Wert der Negativkontrolle aufweist, sowie die Menge der antigenspezifischen T Helferzellen (CD4+, orange) und zytotoxischen T Zellen (CD8+, rot). Die Kuchendiagramme spiegeln die Qualität der stimulierten T Zellantworten wider und zeigen die Verteilung von mono- (blau), bi- (rot) und tri-funktionalen (grün) T Lymphozyten. Je mehr Funktionen die Zellen aufweisen, umso effizienter ist ihre Wirkungsweise (modifiziert nach Mittal et al. Nanomedicine 2015).

Impfung stellt die effektivste medizinische Intervention in der Geschichte der Medizin dar. Der Mensch wird dabei prophylaktisch vor Krankheiten geschützt und dies im Idealfall ein Leben lang. Im Gegensatz zu krankheitsbehandelnden Maßnahmen ist zu dem nicht nur das Individuum, sondern auch sein Umfeld besser vor Krankheiten geschützt. Je mehr Menschen also geimpft sind, umso größer die „Herdenimmunität". Trotz vieler Erfolge bei der Vorbeugung von Krankheiten besteht aber auch heute noch ein Bedarf an neuen, effizienten Impfstoffen.

Aufgrund der Globalisierung können sich Krankheiten heutzutage viel schneller ausbreiten (z.B. Ebola), neue Krankheiten treten in Erscheinung (z.B. Schweinegrippe) und gegen andere konnte bislang noch kein Impfstoff entwickelt werden (z.B. HIV). Hinzu kommt, dass in vielen Ländern, wie auch in Deutschland, die Impfmüdigkeit zunimmt. Sei es aus Angst vor Nebenwirkungen oder weil vermeintlich keine Notwendigkeit mehr besteht, da viele Krankheiten kaum noch auftreten. Dass dieser Umstand weitgehend auf Impfkampagnen zurückzuführen ist, findet dabei kaum Beachtung.

Heutige Impfstoffe basieren entweder auf (i) inaktivierten oder (ii) in ihrer Virulenz abgeschwächten Krankheitserregern oder sie beinhalten lediglich (iii) Bestandteile (Antigene) von Bakterien oder Viren. Letztere, sogenannte subunit-Vakzine sind zwar besonders sicher, da es keine Möglichkeit gibt, dass die Krankheit ausbrechen könnte, allerdings sind sie in ihrer Wirksamkeit eingeschränkt. Um dieses Defizit überwinden zu können, müssen neue Impfstrategien entwickelt werden, die eine sichere und effiziente Impfung erlauben. Mögliche Auswege aus diesem Dilemma könnten neue Darreichungsformen mittels Nanopartikeln (NPs) sein.

Nanopartikel als Darreichungsform

Solche Partikel können die Immunogenität, d.h. die Fähigkeit, das Immunsystem zu aktivieren, erhöhen, indem sie einerseits durch ihre Größe auf das Antigen aufmerksam machen und andererseits verhindern, dass das Antigen vorzeitig zerfällt. Mit Hilfe der Nanopartikel verbleiben Antigene länger im Körper und werden besser von den antigenpräsentierenden Zellen (APCs) des Immunsystems aufgenommen und verarbeitet.

Dies führt schließlich zu einer verstärkten Immunantwort, die es unter Umständen erlaubt, deutlich weniger Antigen einsetzen zu müssen, das sogenannte „Dose sparing".
Beispiele für solche NP sind Polylactid-co-Glycolid (PLGA) oder Chitosan gekoppelte PLGA (Chit-PLGA), deren Nutzen für die Verabreichung per Injektion über die Haut (intradermal (ID)) bereits vielfach untersucht und bestätigt wurde. Heutige Bestrebungen zielen aber vor allem darauf, nadelfreie, d.h. nicht invasive Impfstrategien zu entwickeln, die eine einfache und sichere Handhabung erlauben.

Immunisierung über die Haut

Eine solche Strategie stellt die transkutane Immunisierung (TCI) dar, bei der ein Impfstoff einfach auf die Haut aufgetragen wird. Das Problem hierbei ist jedoch, dass der Impfstoff zunächst die Hautbarriere passieren muss, um die Zellen des Immunsystems zu erreichen. So gibt es in den unterschiedlichen Schichten der Haut verschiedene Zellen des angeborenen Immunsystems, wie die dendritischen (DCs) oder Langerhans (LCs) Zellen. Bisher wurden daher verschiedene Methoden getestet, die diese Barriere zeitlich begrenzt durchlässig machen. Neben dem Einsatz chemischer Substanzen wurden Verfahren ähnlich dem Wachsen verwendet, sowie Mikronadeln und Apparaturen, mit denen der Impfstoff in die Haut injiziert werden kann (z.B. Gene gun, Powderject). Durch kleine Stromstöße (Elektroporation) kann das Stratum corneum ebenfalls durchlässig gemacht werden. Der große Nachteil dieser Methoden besteht allerdings darin, dass auch Krankheitserreger die Öffnungen in der Haut nutzen können, um in den Körper einzudringen.

Der Ansatz, der am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI) aus diesem Grund verfolgt wird, beruht auf Mechanismen, die allergischen Reaktionen der intakten Haut voraus gehen. So dringen z.B. Pollen in Haarfollikel ein und gelangen dort in Kontakt mit Immunzellen, wodurch schließlich allergische Reaktionen ausgelöst werden können. Diesen Weg der transfollikularen Applikation (TF) hat man sich zu Nutze gemacht, um den Impfstoff mittels NPs zu den peri-follikularen APCs zu transportieren, ohne dabei die schützende Hautbarriere zu verletzen (Abb. 1).

NPs eignen sich hierfür besonders, da sie akkumulieren und tiefer in die Haarfollikel eindringen können als konventionelle Impfstoffformulierungen. So konnte zunächst ex vivo an Schweineohren gezeigt werden, dass mit Hilfe der NPs etwa zwei- bis dreimal so viel Antigen in die Haarfollikel gelangt als ohne NPs. Ferner konnte mit Hilfe des adoptiven Zelltransfers gezeigt werden, dass der Transport zu den Immunzellen in der Haut auch in vivo stattfindet. Bei diesem Experiment wurden in einem Maus-Modell vor der Impfung antigenspezifische T-Lymphozyten transferiert. Diese beginnen sofort sich zu teilen, sobald sie mit den APCs, die den Impfstoff präsentieren, in Kontakt kommen. Dies kann aber nur dann geschehen, wenn der Impfstoff zuvor über die Haarfollikel zu den APCs vorgedrungen ist. Das Modell ist sehr sensitiv, da dem Immunsystem etwa tausendmal mehr antigenspezifische Zellen zur Verfügung stehen, als nach einer Impfung oder auch Infektion. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Zellen, die in Versuchstiere transferiert wurden, welche den Impfstoff bestehend aus dem Modellantigen Ovalbumin (OVA) und den PLGA-NPs erhalten haben, deutlich stärker teilen als jene, die lediglich OVA erhalten haben.

In vivo Tests


Nachdem der Beweis erbracht war, dass der Transport eines Antigens über die Haarfollikel ohne Zerstörung der Hautbarriere grundsätzlich möglich ist, wurde die Effizienz einer solchen Impfung in vivo untersucht. Hierzu wurde vor der TF Impfung in einer Gruppe der Tiere deren Haut lediglich rasiert. Um zu gewährleisten, dass die Haut auch ohne weitere Vorbehandlung nicht allein schon durch die Rasur verletzt wurde, ist vor und nach der Rasur die Integrität der Haut überwacht worden, indem der transepidermale Wasserverlust (TEWL) bestimmt wurde. Wird die Haut verletzt, so kommt es zu geringem Wasserverlust und die Leitfähigkeit der Haut ändert sich. Interessanterweise haben die Untersuchungen gezeigt, dass obwohl keinerlei sichtbare Verletzungen vorlagen, die normale unbehandelte Haut bereits 30 Minuten nach der Rasur einen erhöhten TEWL-Wert aufwies, d.h. die Barrierefunktion der Haut eingeschränkt war. Erst zwei Tage nach der Rasur wurde der Ausgangswert wieder erreicht und somit auch die Schutzfunktion wieder hergestellt. Aus diesem Grund wurden die Immunisierungen immer erst zwei Tage nach der Rasur durchgeführt. Bei einer zweiten Gruppe von Versuchstieren wurde vor dem TF Impfen der obere Zellverband des Stratum corneums mittels sog. „tape-stripping" abgelöst. Diese Vorbehandlung führt neben der erhöhten Permeabilität der Haut zwar auch zu einer unspezifischen Aktivierung des angeborenen Immunsystems und damit zu einer verstärkten Immunogenität des topisch applizierten Impfstoffes, dies wird jedoch mit dem Nachteil eines erhöhten Infektionsrisikos durch die kurzzeitige Zerstörung der Hautbarriere erkauft.

Pharmazeutische Hilfsstoffe verstärken den Effekt


Neben dem Einsatz von NPs wurde außerdem untersucht, ob die zusätzliche Verwendung eines Adjuvants die Wirkung dieser Impfung noch weiter verbessert. Adjuvantien sind Stoffe, die in der Lage sind, Immunantworten gegen ein Antigen zu verstärken, indem sie z.B. (i) verhindern, dass das Antigen vorzeitig zerstört wird, (ii) das Antigen über einen längeren Zeitraum im Körper freisetzten (z.B. Aluminiumsalze), oder (iii) dem Immunsystem „Gefahr" signalisieren. Das verwendete Adjuvans c-di-AMP (zyklisches di-Adenosinmonophosphat) gehört zu der Familie der zyklischen di-Nukleotide und dient Bakterien als Botenstoff (second messenger). Frühere Studien haben ergeben, dass c-di-AMP in der Lage ist antigenspezifische Immunantworten zu verstärken und sowohl die Produktion von Antikörpern als auch zelluläre Immunantworten zu fördern.

In Versuchen konnte gezeigt werden, dass die TF Immunisierung sogar über die intakte Haut (d.h. ohne tape stripping) mit OVA beladenen NPs zusammen mit c-di-AMP eine wesentlich stärkere Antikörperproduktion ausgelöst hat, als die Immunisierung über die durch stripping vorbehandelte und in ihrer Barrierefunktion geschädigte Haut mit OVA beladenen NPs allein. Wurde die TF Immunisierung gar ohne NPs durchgeführt, so konnte kaum eine Antikörperproduktion beobachtet werden (Abb. 2). Neben der verstärkten Antikörperproduktion hat der Einsatz von c-di-AMP auch zu einer verbesserten zellulären Immunantwort geführt. Im Gegensatz zu den OVA beladenen NPs allein hat die das c-di-AMP enthaltene Impfstoffformulierung nicht nur T Helferzellen des Typs 2 (Th2), sondern auch des Typs 1 (Th1) verstärkt stimuliert (Abb. 2). Während Th2 Zellen überwiegend die Antikörperproduktion unterstützen, helfen Th1 Zellen hauptsächlich bei der Zerstörung infizierter Zellen. Darüber hinaus wurden die stimulierten zellulären Immunantworten durch die Kombination von NPs und Adjuvans aber nicht nur verstärkt, sondern auch deren Qualität gesteigert. So gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass antigenspezifische Immunzellen, die gleichzeitig mehrere Effektormoleküle (Zytokine) produzieren, effizienter in der Lage sind einen Krankheitserreger zu bekämpfen als solche, die nur eines produzieren. Diese multifunktionalen Zellen können entweder die Zerstörung infizierter Zellen effizienter fördern (Th1 Zellen) oder selbst infizierte Zellen besser abtöten (zytotoxische T Zellen (CD8+)).

In diesem Fall wurden durch die TF Impfung über intakte Haut mit OVA beladenen NPs und c-di-AMP deutlich mehr Th1 Zellen und CD8+ Zellen stimuliert, die gleichzeitig IFNγ und TNFα bzw. IFNγ und IL-2 oder gar alle drei Zytokine sekretierten, als durch OVA beladenen NPs allein bzw. nach Vorbehandlung der Haut (Abb. 2). Während IL-2 benötigt wird, um die T Zellantworten auszubauen, fördern IFNγ und TNFα die zytolytische Aktivität der Zellen.

Die beschriebenen Steigerungen der Immunantworten könnten auf verschiedene Mechanismen zurückzuführen sein. Ein wesentlicher Vorteil beruht sicherlich auf dem verbesserten Transport des Antigens zu den Immunzellen (APCs) durch die NPs. Einmal hier angekommen werden die Immunzellen durch das Adjuvans zusätzlich aktiviert. Dieser Effekt führt schließlich zu einer verbesserten bzw. verstärkten Funktionalität der APCs, die daraufhin zu den Lymphknoten wandern, wo sie letztlich durch die Präsentation des Antigens das adaptive Immunsystem initiieren.

Zusammenfassung


Es konnte gezeigt werden, dass eine Impfung über die intakte Haut grundsätzlich möglich ist, indem man den Impfstoff mit Hilfe von NPs zu den Immunzellen in den Haarfollikeln bringt. Darüber hinaus scheint der Einsatz eines Adjuvans notwendig zu sein, um sowohl effiziente Antikörperantworten als auch zelluläre Immunantworten zu stimulieren.

Autoren
Schulze, K.1, Mittal, A.2, Hansen, S.2, Ebensen, T.1, Weißmann, S.1, Guzman, C.A.1 und C.-M. Lehr2
1Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI), Abteilung Vakzinologie und Angewandte Mikrobiologie, Braunschweig
²Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland (HIPS), Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI), Abteilung Wirkstoff-Transport, Universität des Saarlandes, Saarbrücken

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Inhoffenstr. 7
38124 Braunschweig
Germany
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Telefax: +49 531 6181 2655
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