In den letzten Jahren haben laut Kriminalstatistik die Betrugsfälle durch Produkt- und Markenpiraterie drastisch zugenommen. Besonders kritisch ist die Zahl gefälschter und somit potenziell gefährlicher Produkte bei Lebensmitteln, Körperpflege und Pharmazeutika. Nicht nur große internationale Konzerne, sondern auch mittelständische Unternehmen sind von solchen Plagiaten betroffen. Vor diesem Hintergrund wird ein analytisches Verfahren entwickelt, das die Herkunft bzw. Authentizität von Verbindungen bestimmt, die der substanzspezifischen Isotopenanalyse bislang nicht zugänglich waren. Dieser Ansatz verknüpft die Flüssigchromatografie (HPLC) unter Einsatz eines Raman-Detektors mit der Isotopenverhältnismassenspektrometrie (IRMS, isotope ratio mass spectrometry).

In den letzen Jahren hat sich die substanzspezifische Isotopenanalyse zu einem wichtigen Verfahren in verschiedenen wissenschaftlichen und mit diesen verknüpften gesellschaftlichen Disziplinen entwickelt. Um nur einige Beispiele der Anwendungsbreite dieses Verfahrens aufzuzeigen, sei hier die Dopinganalytik von Steroiden, die Authentizität von Lebensmitteln, die Quellallokation von Grundwasserkontaminanten in Aquiferen, die Quantifizierung des biologischen Abbaus von Schadstoffen und die Aufklärung von Stoffwechselprozessen mit nichtradioaktiven Tracern im menschlichen Körper erwähnt [1-3]. Alle chemischen Reaktionen, die entweder durch Enzyme katalysiert bzw. die im Labor und der Industrie durchgeführt werden, führen zu einer Fraktionierung der stabilen Isotope der an der Reaktion beteiligten Elemente innerhalb der reagierenden Moleküle. Mit Hilfe der Isotopenfraktionierung, die ihren Ursprung in unterschiedlichen Bindungsstärken zwischen leichten und schweren Isotopen eines Elements hat, können u.a. Aussagen über die (geografische) Herkunft einer Verbindung gemacht werden.

Dabei werden im Bereich der IRMS in der Regel keine absoluten Gehalte der einzelnen Isotope angegeben, sondern lediglich Verhältnisse von schwerem zu leichtem Isotop (z.B. ¹³C/¹²C oder ¹⁸O/¹⁶O etc.) in einer Probe oder einer Verbindung. Um diese Verhältnisse über längere Zeiträume und zwischen Laboratorien vergleichbar zu machen, wird dieses Verhältnis darüber hinaus auf einen internationalen Referenz-Standard bezogen und in Promille angegeben.

Man spricht dann von sog. δ-Werten.

Die Kopplung der IRMS der stabilen Isotope des Kohlenstoffs mit der Flüssigchromatografie beruht auf der Verwendung einer mobilen Phase, die keinen Kohlenstoff enthalten darf. In der Regel wird eine rein wässrige mobile Phase verwendet, deren pH-Wert über anorganische Puffer eingestellt werden kann. Die Temperatur ist neben dem pH-Wert deshalb der zentrale Parameter zur Beeinflussung der Polarität der mobilen Phase. Die Hochtemperatur-HPLC spielt deshalb eine besondere Rolle, da nur über die Anwendung von Temperaturgradienten eine Elution unterschiedlich polarer Komponenten in einem chromatografischen Lauf erzielt werden kann [4].

Bei der online Kopplung zwischen Flüssigchromatografie und IRMS erfolgt zunächst die Trennung eines Substanzgemisches mittels HPLC. Die getrennten Substanzen werden online bei knapp 100°C und niedrigem pH-Wert nasschemisch oxidiert und das gebildete CO₂ aus jeder Komponente über eine Membran mittels Helium ausgetrieben. Das CO₂ wird dann nach entsprechender Trocknung dem Isotopenverhältnismassenspektrometer zugeführt und das Verhältnis zwischen den stabilen Isotopen ¹³C und ¹²C bestimmt.

Um die Temperatur als aktiven Parameter in der Flüssigchromatografie zu nutzen, müssen verschiedene Voraussetzungen erfüllt sein. Zum Einen wird für die Temperierung von mobiler und stationärer Phase ein Hochtemperatur-Säulenofen benötigt. Dieser muss in der Lage sein, die mobile Phase vor dem Eintritt in die Trennsäule vorzuheizen. Des Weiteren ist es erforderlich, die mobile Phase nach Verlassen der Trennsäule auf eine definierte Temperatur herunterzukühlen. Ein derart konzipiertes Heizsystem ist kommerziell verfügbar und modular aufgebaut (siehe Abbildung 1). Dieses System besteht aus einer Eluentenvorheizung, der Säulenbeheizung und der Eluentenkühlung. Jedes dieser Module kann separat gesteuert und programmiert werden. Das Heizsystem arbeitet in einem Temperaturbereich von 30-200°C, wobei Temperaturgradienten mit einer Heizrate von bis zu 30°C/min generiert werden können.

Eine weitere Voraussetzung für den Routineeinsatz der Hochtemperatur-HPLC ist die Temperaturstabilität der stationären Phase. Zurzeit sind nur wenige Trennsäulen kommerziell verfügbar, die eine hinreichende Temperaturstabilität besitzen. Neben den metalloxidischen Trennsäulen auf Basis von Titan- oder Zirkoniumdioxid stehen nun auch Hybridmaterialien auf Basis von Siliziumdioxid zur Verfügung, die aufgrund ihrer sehr guten Temperaturstabilität bei hohen Temperaturen über 100°C eingesetzt werden können [5, 6]. Besonders hervorzuheben ist z.B. die Temperatur- und pH-Stabilität der Waters BEH Materialien.
In Abbildung 2 ist beispielhaft das Chromatogramm einer Trennung ausgewählter Sulfonamide gezeigt. Als mobile Phase wurde reines Wasser verwendet und die Trennung wurde in einem Temperaturbereich von 60-180°C durch Anwendung eines Temperaturgradienten erzielt. Die einzelnen Substanzen sind basisliniengetrennt, die kritische Auflösung zwischen Sulfadiazin und Sulfathiazol beträgt 3,4.