Licht verformt Zellen

Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Zellmechanik

  • Abb. 1: Stressprofil einer Zelle in der optischen Zweistrahlfalle (oben links); Laserpattern und Deformationsprofil mit Phasenkontrastaufnahmen einer suspendierten Zelle (rechts)Abb. 1: Stressprofil einer Zelle in der optischen Zweistrahlfalle (oben links); Laserpattern und Deformationsprofil mit Phasenkontrastaufnahmen einer suspendierten Zelle (rechts)
  • Abb. 1: Stressprofil einer Zelle in der optischen Zweistrahlfalle (oben links); Laserpattern und Deformationsprofil mit Phasenkontrastaufnahmen einer suspendierten Zelle (rechts)
  • Abb. 2: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Zytostatika auf die Zellverformbarkeit und Relaxation. a), c) Latrunculin A (Depolymerisierung von Aktion). b), d) Jasplakinolid (erhöhte Polymerisation von Aktin).
  • Abb. 3: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Zytostatika auf die Zellverformbarkeit und Relaxation. a), c) Nokodazol (Destabilisierung der Mikrotubuli). b), d) Taxol (Stabilisierung der Mikrotubuli).

Die mechanischen Eigenschaften von Zellen können stark deren Funktion beeinflussen. Mit einem neuen automatisierten Messverfahren, lässt sich dieser Parameter nun auch mit Durchsatzraten messen, die Wirkstoffscreenings erlauben. Dadurch eröffnen sich neue Möglichkeiten für die Krebsforschung und die kosmetische Industrie.

Die Zellbiologie hat in den letzten Jahrzehnten rasant Fortschritte gemacht. Neue Technologien ermöglichen die Entschlüsselung des gesamten Erbguts einer Zelle, Proteine können gezielt manipuliert oder ausgeschaltet werden und man erhält dadurch tiefe Einblicke in die biochemischen Abläufe, die das Leben ermöglichen aber auch Krankheiten hervorrufen können. Mithilfe neuer Verfahren konnten viele wichtige wissenschaftliche Fragen beantwortet werden, obgleich es noch viele unbeantwortete gibt. Die Ursache hierfür liegt in der Komplexität der biochemischen Reaktionen. Auch für einfache Zellfunktionen ist das Netzwerk biochemischer Reaktionen nur schwer überschaubar. Hinzu kommt, dass viele Abläufe redundant und somit nicht eindeutig beschreibbar sind.

Biomechanik als Marker für den Zellzustand
Um biologische Abläufe bestmöglich zu verstehen ist es wichtig, diese gezielt zu reduzieren und die biochemischen Erkenntnisse mit den funktionellen Eigenschaften von Zellen zu verbinden. Einige wenige dieser funktionellen Parameter, z.B. Proliferation oder Transmigration, sind bereits über standardisierte Assays zugänglich. Oft fehlt es jedoch an zuverlässigen und einfach zu handhabenden Messmethoden. Ein Bereich, in dem sich in den letzten Jahren viel bewegt hat, ist die Charakterisierung der Zellmechanik.

Die Bedeutung der mechanischen Eigenschaften von Zellen für die Motilität, Morphogenese, Entwicklung von Krebs oder Stammzelldifferenzierung wurde schon vor etlichen Jahren mithilfe aufwändiger Methoden wie Mikropipettenaspiration oder Rasterkraftmikroskopie erkannt. Um aussagekräftige, statistisch belastbare Daten zu erhalten, kann man heute auf die Methode des optischen Streckens zurückgreifen. Die hier vorgestellte Technik zur Verformung suspendierter Zellen erlaubt automatisierte Messungen mit hohem Durchsatz.

Optische Verformung biologischer Zellen
Dass Licht Kräfte ausüben kann, ist im Alltag nicht zu spüren.

Im mikroskopischen Bereich jedoch können diese Kräfte genutzt werden, um Gegenstände zu halten oder auch zu verformen. Biologische Zellen sind dafür ideal geeignet, sie sind transparent und haben einen höheren Brechungsindex als das Zellkulturmedium. Wenn das Licht (in diesem Falle Laserlicht der Wellenlänge 1064 nm) die Zellen durchquert, erfährt es aufgrund des Brechungsindexunterschiedes eine Impulsänderung. Diese wird durch senkrecht an der Zelloberfläche ansetzende Kräfte kompensiert [1]. Mithilfe zweier gegenüberliegender Laser können die Zellen stabil in einer Position eingefangen und bei höherer Leistung auch verformt werden (Abb. 1) [2]. Die Verformung wird durch die Auswertung von Videosequenzen detektiert.

Der Einfluss von Wirkstoffen auf die Biomechanik
Das Vermessen hoher Zellzahlen und der geringe Arbeitsaufwand durch die Automatisierung sind eine wichtige Voraussetzung für die Anwendung im Wirkstoffscreening. Um die Frage zu klären, welche Bestandteile des Zytoskeletts (Mikrotubuli, Aktin, Intermediärfilamente) hauptsächlich für die mechanische Integrität verantwortlich sind, wurde eine Reihe an Wirkstoffen in Abhängigkeit von der Konzentration und der Laserleistung untersucht. Die Wirkstoffe Latrunculin A und Jasplakinolid verringern, bzw. verstärken die Bildung von Aktinfilamenten. Nokodazol und Taxol hingegen stabilisieren, bzw. destabilisieren die Mikrotubuli. Sowohl Aktinfilamente als auch Mikrotubuli sind Hauptbestandteile des Zytoskeletts. Zur Behandlung der Wirkstoffe wurden diese in DMSO aufgelöst. Jeweils 100 µg des Wirkstoffes in DMSO wurden dann jeweils in 5 ml Zellkulturmedium weiter verdünnt. Diese Stammlösungen wurden dann in der für die Endkonzentration benötigten Menge den Zellkulturen zugegeben. Nach Einwirkdauern von 18 h für Taxol, 10 h für Nokodazol, 6 h für Jasplakinolid und 2 min für Latrunculin A wurden die Zellen im Optical Stretcher (RS Zelltechnik) gemessen. Abbildungen 2 und 3 zeigen die Verformung der Zellen durch einen 2 Sekunden langen, 1200 mW und 750 mW starken Laserpuls. Neben der Verformung, wurde auch die Relaxation nach dem Laserpuls der Zellen ausgewertet (Abb. 1). Daraus lassen sich Aussagen über das plastische Verhalten der Zellen ableiten. Bei einigen Zellen konnte darüber hinaus ein aktives Verhalten beobachtet werden. Damit ist gemeint, dass die Zellen sich nach dem Ausschalten des Lasers weiter ausdehnten. Da dies in einem anisotropen viskoelastischen Material nicht vorkommt, gehen wir davon aus, dass es sich daher um einen von der Zelle aktivierten Prozess handelt.

Aktin und Zelldeformation und –relaxation
Bei 750 mW, also einer vergleichsweise kleinen Kraft, führte die Depolymerisierung des Aktins durch Latrunculin A zu einer Zunahme der Verformbarkeit um bis zu 75% (Abb. 2a). Überraschenderweise führt eine verstärkte Polymerisation des Aktins durch Jasplakinolid zu einer um bis zu 53% erhöhten Verformbarkeit (Abb. 2b). Bei höherer Belastung der Zellen (1200 mW) kam es zu einer maximalen Zunahme der Verformbarkeit unter Latrunculin A um 65% (Abb. 2a), wohingegen das Jasplakinolid keinerlei Auswirkungen zeigte (Abb. 2b). Beide Wirkstoffe führten unter kleineren Verformungen zu aktivem Verhalten in der Relaxation (Abb. 2c und d). Bei höheren Laserleistungen jedoch wurden die Latrunculin A behandelten Zellen plastischer, wohingegen das Jasplakinolid keinen Effekt mehr zeigte.

Mikrotubuli und Zelldeformation und –relaxation
Wie in Abbildung 3a gezeigt, führte die Zerstörung der Mikrotubuli durch Nokodazol zu keiner deutlichen Änderung der relativen Zelldeformation bei 750 mW, ebenso wenig die Stabilisierung der Mikrotubuli durch Taxol (Abb. 3b). Bei 1200 mW änderte sich die Verformbarkeit durch Zugabe von Nokodazol lediglich an der höchsten vermessenen Konzentration von 20 µM um 20 % (Abb. 3a). Im Gegensatz dazu zeigte die Zugabe von Taxol einen bipolaren Effekt: Die Stabilisierung der Mikrotubuli führte bei geringeren Konzentrationen zu einer höheren Verformbarkeit der Zellen, versteifte diese aber bei höheren Taxolkonzentrationen (Abb. 3b).

Bei der Wirkung auf die Relaxation zeigt sich ein anderes Verhalten. Die Destabilisierung der Mikrotubuli durch Nokodazol bewirkte bei geringer Laserleistung eine Abnahme der Deformation (Abb. 3c). Die Stabilisierung der Mikrotubuli zeigte bis zu einer Konzentration von 50 nM eine Abnahme der Relaxation. Bei höheren Konzentrationen wurde jedoch die weiter oben beschriebene aktive Verformung beobachtet (Abb. 3d). Bei 1200 mW bewirkten beide Wirkstoffe eine tendenzielle Abnahme der Relaxation (Abb. 3c und d).

Schlussfolgerungen
Die oben beschriebenen Untersuchungen wurden an insgesamt über 10.000 Zellen durchgeführt. Dabei wurde nicht nur die Abhängigkeit von der Art der Strukturänderung des Zytoskeletts untersucht, sondern auch die Abhängigkeit von der Konzentration des eingesetzten Wirkstoffes. Dabei zeigte sich keine allgemeine Dominanz einer der beiden Zytoskelettbestandteile. Für Zelldeformationen bei geringer Kraft dominierte das Aktin, bei höheren Kräften sind beide Akteure beteiligt. Ein ähnliches Szenario ergibt sich für das Relaxationsverhalten, jedoch sind es in diesem Falle die Mikrotubuli, welche bei geringeren Verformungen die Steifigkeit der Zelle bestimmen; erst bei höheren Kräften wird sie auch durch Aktin mit beeinflusst. Sehr interessant ist auch die Konzentrationsabhängigkeit der Effekte. Besonders das Mikrotubuli-versteifende Taxol fiel dabei durch seine bipolaren Effekte auf. Je nach Menge des zugegebenen Wirkstoffes konnte die Wirkung umgekehrt werden. Mit der Implikation, dass Mikrotubuli es Tumorzellen erleichtert, sich während der Metastase z. B. an Gefäßen anzuhaften [3], könnte der bipolare Effekt des Taxols auf die Zellverformbarkeit die Zunahme von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) unter Taxolbehandlung vor der Operation erklären [4]. Da auch bei vielen anderen Wirkstoffen die Auswirkung auf die Biomechanik und damit auf den Zellzustand unbekannt sind, könnten solche Screenings größeren Aufschluss über in den Zellen stattfindende Prozesse liefern und evtl. unerwünschte Nebenwirkungen frühzeitig aufzeigen. Ein anderer Bereich mit Fokus auf Zellelastizität ist die Kosmetikindustrie, wo durch Wirkstoffscreenings bezüglich des mechanischen Phänotyps der Zellen schon früh eine Auswirkung verschiedener Substanzen auf den Zellzustand abgeschätzt werden kann.

Autoren
Susanne Rönicke1, Kenechukwu David Nnetu2, Roland Stange1

Zugehörigkeiten
1RS Zelltechnik GmbH, Leipzig
2Universität Leipzig, Abt. Physik der weichen Materie

Kontakt
Susanne Rönicke
RS Zelltechnik
Leipzig
sroenicke@rszelltechnik.com

Literatur
[1]  J. Guck, R. Ananthakrishnan, T. J. Moon, C. C. Cunningham, und J. Käs, „Optical Deformability of Soft Biological Dielectrics“, Phys. Rev. Lett., Bd. 84, Nr. 23, S. 5451–5454, (2000), DOI:10.1103/PhysRevLett.94.098103

[2]  J. Guck, R. Ananthakrishnan, H. Mahmood, T. J. Moon, C. C. Cunningham, und J. Käs, „The Optical Stretcher: A Novel Laser Tool to Micromanipulate Cells“, Biophys. J., Bd. 81, Nr. 2, S. 767–784, (2001), DOI:10.1016/S0006-3495(01)75740-2

[3] M. A. Matrone, R. A. Whipple, E. M. Balzer, und S. S. Martin, „Microtentacles tip the balance of cytoskeletal forces in circulating tumor cells“, Cancer Res., Bd. 70, Nr. 20, S. 7737–7741, (2010), DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-1569

[4]  O. Camara, M. Rengsberger, A. Egbe, A. Koch, M. Gajda, U. Hammer, C. Jörke, C. Rabenstein, M. Untch, und K. Pachmann, „The relevance of circulating epithelial tumor cells (CETC) for therapy monitoring during neoadjuvant (primary systemic) chemotherapy in breast cancer“, Ann. Oncol. Off. J. Eur. Soc. Med. Oncol. ESMO, Bd. 18, Nr. 9, S. 1484–1492, (2007), DOI:10.1093/annonc/mdm206

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