MALDI-Massenspektrometrie in der Arzneimittelforschung

Tiefere Einblicke gewinnen

  • Abb. 1: Die Ionenoptik eines  TOF/TOF-Massenspektrometers montiert  auf einer optischen Bank (2)
  • Abb. 2: Optische Scans von Gewebeschnitten der Niere von juvenilen Ratten (7–13 Tage postnatal) (4)
Neue MALDI-Technologie wird die Entdeckung und frühe Entwicklung von Wirkstoffkandidaten vorantreiben, indem sie Forschern neue Informationen liefert und verbesserte Leistung bietet – sowohl bei der Auswahl der Targets als auch bei der Bildgebung der Wirkstoffverteilung im Gewebe.
 
Einleitung
 
In diesem Artikel werden die jüngsten Innovationen der Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Massenspektrometrie (MALDI-MS) im Zusammenhang mit zwei Detektionssystemen vorgestellt.
 
In der Pharmaindustrie ist es Praxis Substanzbibliotheken möglichst schnell auf „Treffer“ zu durchsuchen, wobei ein hoher Automatisierungsgrad der eingesetzten Technologien angestrebt wird. Meist werden möglichst frühzeitig ADME- und Toxizitätsstudien (zu Absorption, Distribution, Metabolismus und Exkretion bzw. Toxizität) integriert, um wesentliche Details der Verteilung und Metabolisierung des Wirkstoffs zu verstehen. Im Jahresvergleich (2016 gegenüber 2015) lag das Wachstum der Wirkstoffpipeline in der Pharmaindustrie schätzungsweise bei 11,5%. Die Zahl der dokumentierten Substanzen in der präklinischen Phase stieg von 6.061 auf 6.861 an (1).
 
Voraussetzungen schaffen
 
Die wünschenswerten Eigenschaften eines idealen Analysetools für niedermolekulare Arzneimitteln in F&E sind: markierungsfrei, keine Sonden und die Möglichkeit zur direkten und quantitativen Messung der Target-Analyten. Weitere Kriterien auf den Wunschlisten sind: schnell, robust, leichte Handhabung, kostengünstig und automationsbereit. 
 
Die Massenspektrometrie erfüllt grundsätzlich viele dieser Kriterien, und somit hat sich in den letzten Jahren ein neues Einsatzgebiet für die MALDI-MS entwickelt. MALDI wird in unterschiedlichen MS-Analysatoren angewendet, am häufigsten bei den axialen TOF-Detektoren (TOF = Time of Flight), aber auch andere Techniken wie orthogonale TOF oder FT-ICR (= Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) werden, je nach den analytischen Erfordernissen, eingesetzt. 
 
Die Bildgebung auf Basis der MALDI-Massenspektrometrie (MSI – Massenspektrometrisches Imaging) trägt zum besseren Verständnis der Verteilung eines Wirkstoffkandidaten und seiner Metaboliten im Gewebe bei, bevor Experimente zur quantitativen Ganzkörperautoradiographie (QWBA) durchgeführt werden.

Dies ermöglicht fundiertere, informationsbasierte Entscheidungen darüber, ob der Kandidat in die nächste Entwicklungsphase übernommen werden soll oder nicht. 

 
Wichtig ist auch, dass aus vielen möglichen Substanzen Metaboliten mit eigener biologischer Aktivität generiert werden. Diese aktiven Metaboliten können unterschiedliche pharmakologische und pharmakokinetische Eigenschaften im Vergleich zum Ausgangswirkstoff aufweisen. Ein umfassendes Verständnis der Eigenschaften aktiver Metaboliten ist von zentraler Bedeutung für die Einschätzung der Toxizität als häufigstem Grund für die Rücknahme eines Arzneimittels. 
 
Neue Technologie
 
Die Ziele für einen Anwender können für jede Applikation spezifisch sein, z. B. Geschwindigkeit der Messung, Durchsatz und Kosten pro Probe beim Hochdurchsatz-Screening (HTS) gegenüber Auflösung und Sensitivität bei Bildgebungsverfahren. Die Verbesserung und Optimierung der kritischen Komponenten für eine bestimmte Anwendung kann aber auch Verbesserungen für alle anderen mit sich bringen. 
 
Das „Herz“ eines MALDI-Systems ist der Laser, der mit einer Frequenz von bis zu 10 kHz arbeiten kann. Stabilität ist sowohl für die räumliche als auch die massenbezogene Auflösung von kritischer Bedeutung. Die Leistungsfähigkeit kann signifikant durch eine verbesserte Präzision der ionenoptischen Bank (Abb. 1), auf der die Ionenoptik, bestehend aus Linsen, Reflektoren und Detektoren, montiert ist, gesteigert werden. 
 
Moderne Systeme verfügen über einen 10-kHz-Laser; dessen Einbau einige technische und mechanische Probleme mit sich bringt, die es zu lösen gilt. So wird bei herkömmlichen Geräten die Probe beispielsweise jeweils in Relation zu einem fixierten Laserbrennfleck bewegt. Die Mechanik ist eine große Herausforderung. Um das Potenzial des Lasers voll ausschöpfen zu können, kann auch der Laser in Relation zu einer fixen Probenposition bewegt werden. Gleichzeitig wird die Probe verfahren, was hohe Messgeschwindigkeiten bis zu 40 Pixel pro Sekunde ermöglicht. 
 
Im Unterschied zu klassischen MALDI-Massenspektrometern werden bei Systemen der neuen Generation, Strategien der parallelen Datenverarbeitung eingesetzt, um sicherzustellen, dass die Messgeschwindigkeit nicht durch die Datenverarbeitung gebremst wird. 
 
MALDI im Ultrahochdurchsatz
 
Bei der HTS-Konfiguration für hohen Probendurchsatz muss das System bis zu 20-mal schneller als ein herkömmliches MALDI-Gerät sein und gleichzeitig eine verbesserte Robustheit, Sensitivität und einen erweiterten Massenbereich bietet. 
 
In Kombination mit einem Nanoliter-Liquid-Handling-System kann so über eine Million Proben pro Woche mit einem 10-kHz-Laser MALDI-TOF-Gerät, getetstet werden. Die Massenspektren wurden im Massenbereich m/z 80–400 oder 700–3500 jeweils mit 200 Laserpulsen pro Probe aufgenommen,. Unter diesen experimentellen Bedingungen konnte das System eine 1536-Well-Platte in 7,36 Minuten verarbeiten. Eine einfache Extrapolation ergibt, dass die Analyse der enorm großen, unternehmenseigenen Substanzbibliothek von 2 Millionen chemischen Verbindungen nur 7,85 Tage dauern würde. Die Untersuchung der Langzeitstabilität des Systems und der Methodik ergab eine gute Korrelation der Ergebnisse vor Beginn mit denen nach Abschluss der Messungen. 
 
Mit dem Ziel noch höheren Durchsatz zu erreichen, ohne das Linsensystem des Geräts oder andere Komponenten reinigen zu müssen, gelang bei Verwendung von 6144-Well-Platten eine Verkürzung der benötigten Screeningzeit von 2 Million Verbindungen auf 2,39 Tage.
 
Magnetische Resonanz Massenspektrometer
 
Weiterentwicklungen im Detektordesign trugen dazu bei, die Anwendungsbreite von MALDI MS zu erhöhen. Für MALDI Imaging Experimente kann ein durch die Stabilisierung des Ionenzyklotron-Resonanzsignals über einen breiten Massenbereich ein deutlicher Informationsgewinn generiert werden. Sofern kein hoher Durchsatz gefordert ist, können Massenspektren mit einem Auflösungsvermögen von bis zu 10 Millionen aufgenommen werden.
 
Traditionell wurden Methoden wie die quantitative Ganzkörperautoradiographie (QWBA) und/oder Flüssigchromatographie in Kombination mit der Massenspektrometrie (LC-MS-Kopplung) verwendet, um die Verteilung des Wirkstoffs im Gewebe und dessen Metabolismus zu untersuchen. Beide Methoden sind aber auch mit Nachteilen verbunden: Die QWBA ist eine zuverlässige Technik und die mit ihr gewonnenen Daten werden weltweit von den Zulassungsbehörden akzeptiert; allerdings repräsentiert der mittels QWBA erhaltene Wert einen zusammengesetzten Wert der gesamten vorhandenen Radioaktivität, es könnte sich also um jegliche Kombinationen aus Ausgangswirkstoff, Metaboliten, Verunreinigungen und Abbauprodukten handeln. Eine LC-MS-Analyse wird mit Extrakten aus Gewebehomogenaten durchgeführt. Diese Technik liefert keine räumlichen Informationen und ihre Ergebnisse können irreführend sein. Wenn beispielsweise ein Analyt an bestimmten Stellen im Gewebe stark konzentriert, also lokalisiert vorhanden ist, kommt es durch den Extraktions- und Homogenisierungsprozess zu einer Verdünnung; die ursprüngliche Gewebeverteilung wird „maskiert“ und man erhält eine relativ niedrige Konzentration, die mitunter sogar unter der Nachweisgrenze liegen kann. Die lokalisierte Akkumulation eines Analyten ist häufig ein Hinweis für die Toxizität einer Substanz und würde in diesem Fall übersehen. Wenn im Gegensatz dazu im Gewebehomogenat eine hohe Konzentration eines Analyten bestimmt wird, könnte ein Forscher falsche Schlüsse hinsichtlich der Toxizität ziehen, weil für den Analyten eine gleichmäßige Verteilung im gesamten Gewebe angenommen wird.
 
Im Vergleich dazu wird bei der MSI ein herkömmlich präparierter Gewebeschnitt mit einer Matrix beschichtet, die Moleküle aus dem Gewebe extrahiert. Jedoch bleiben dabei die räumlichen Beziehungen im darunter liegenden Gewebeschnitt erhalten. Nach dieser Präparation wird die Probe im Spektrometer gemessen. Als Ergebnis werden räumlich aufgelöste Massenspektren erhalten. Weil mit dem Laser lediglich die Matrixkristalle auf der Oberfläche des Schnitts untersucht werden, bleiben die darunter liegenden zellulären Strukturen erhalten und können mit einem Standardverfahren histologisch angefärbt werden, sodass ein qualitativ hochwertiges histologisches Bild gewonnen werden kann. Durch die Zusammenführung dieses Scans mit den molekularen Daten des MALDI-Massenspektrometer-Experiments kann eine histologisch orientierte Analyse des Gewebes durchgeführt werden.
 
MALDI-MSI in der Anwendung
 
im Rahmen einer Studie zur Nephrotoxizität des Krebsmedikaments Dabrafenib (DAB) bei Ratten wurden die über die LC-MS Ergebnisse hinausgehenden zusätzlichen Informationen beurteilt, die durch die MALDI-MSI geliefert wurden (3). Diese Forschungsarbeit trug dazu bei, dass DAB für die Anwendung bei Patienten in der Pädiatrie entwickelt wurde. Bei vorherigen Studien waren einige unerwartete Nebenwirkungen in den Nieren juveniler Ratten identifiziert worden. Diese Effekte waren in den Untersuchungen an erwachsenen Tieren nicht beobachtet worden. Zu Beginn konnte mittels der MALDI-MSI die Verteilung von DAB und seiner Metaboliten in der Niere bestimmt werden (Abb. 2). Eine anschließende Analyse tubulärer Ablagerungen, die in den ersten Experimenten festgestellt worden waren, ergab die chemische Zusammensetzung an diesen Stellen und somit Informationen für eine vollständigere Risikoabschätzung bei der Behandlung pädiatrischer Patienten mit Dabrafenib, wie sie mit der LC-MS-Analyse allein nicht möglich gewesen wäre.
 
Fazit
 
Wie im vorliegenden Beitrag beschrieben, wirkt sich die MALDI-Technologie bereits in der F&E niedermolekularer Wirkstoffe aus, und viele Branchenkenner gehen davon aus, dass dieser Einfluss in den kommenden Jahren weiter ansteigen wird. Hervorgegangen aus der Grundlagenforschung, investieren zukunftsorientierte Forscher in diese Analyseinstrumente und erweitern die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik. Es ist zu erwarten, dass mit ihnen zusätzliche Erkenntnisse zu einem Wirkstoffkandidaten und ein tieferes Verständnis seiner potenziellen Wirkweise in frühen Phasen des Entwicklungsprozesses gewonnen werden. 
 
Autoren
Rohan Thakur, Meike Hamester, Dale Shannon Cornett, Jens Fuchser
 
Kontakt   
Dr. Jens Fuchser
Bruker Daltonics
Bremen
 

Referenzen:

[1]. Pharmaprojects 2016. Pharma R&D Annual Review of 2016

[2]. Castellino S, Groseclose MR, Wagner D. MALDI imaging mass spectrometry: bridging biology and chemistry in drug development; 2011; DOI:10.4155/bio.11.232

[3]. M. Reid Grosclose et al. Imaging MS in Toxicology: An Investigation of Juvenile Rat Nephrotoxicity Associated with Dabrafenib Administration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26:887–898. DOI:10.1007/s13361-015-1103-4

[4]. Groseclose, M.R., Laffan, S.B., Frazier, K.S. et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26: 887. doi:10.1007/s13361-015-1103-4

 

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