Mikrokavitäten-Arrays: Eine High-Throughput-/High-Content-fähige 3D-Zellkultur-Plattform

  • Abb. 1: a) Schematische Darstellung eines Mikrokavitäten-Arrays mit den typischen Mikrokavitätendimensionen, Rechts: Aufsicht auf ein Mikrokavitäten-Array mit Positionskoordinaten einzelner Kavitäten im Array.Abb. 1: a) Schematische Darstellung eines Mikrokavitäten-Arrays mit den typischen Mikrokavitätendimensionen, Rechts: Aufsicht auf ein Mikrokavitäten-Array mit Positionskoordinaten einzelner Kavitäten im Array.
  • Abb. 1: a) Schematische Darstellung eines Mikrokavitäten-Arrays mit den typischen Mikrokavitätendimensionen, Rechts: Aufsicht auf ein Mikrokavitäten-Array mit Positionskoordinaten einzelner Kavitäten im Array.
  • Abb. 1: b) Lichtmikroskopische Aufnahme einer Mikrokavität von der Seite. Maßstabsbalken: 300 µm.
  • Abb. 2a): Mikrotiterplatte mit Mikrokavitäten-Arrays  (10 Mikrokavitäten pro Well, 960 insgesamt) im Folienboden.
  • Abb. 2b) Mikrotiterplatte mit Mikrokavitäten-Arrays (169 Mikrokavitäten pro Well, 16.224 insgesamt) im Folienboden.
  • Abb. 3: Hep G2-Zellen, die adhärent in Mikrokavitäten aus Polycarbonat kultiviert wurden. Die Adhäsion der Zellen wurde mit einer vorangegangenen Beschichtung mit Collagen I unterstützt. Grünfluoreszenz: Cytoplasmatische Färbung mit Calcein.
  • Abb. 4: High-Throuput-/High-Content-Screening fähige 3D-Aggregate in Mikrokavitäten-Arrays. Grün: intrazelluläres Protein, Blau: Zellkerne.

Die meisten, der uns aus dem Mikroskop vertrauten Zellkulturen sind aus physiologischer Sicht Artefakte, da sie über mittlerweile gut 100 Jahre fast ausschließlich in zweidimensionaler Art und Weise kultiviert wurden. Dass dies nicht besonders organotypisch ist, erschließt sich von selbst. Ausnahmen bilden hier lediglich solche Zellen, die physiologischerweise als Monolayer vorkommen, wie z.B. Endothelzellen. Die Tatsache, dass dreidimensionale Zellkulturen im Vergleich zu 2D-Systemen nicht nur eine relevantere Morphologie besitzen, sondern häufig auch eine deutlich bessere Vergleichbarkeit zur in vivo-Situation zeigen, wie z. B. in der Metabolisierung von Xenobiotika oder sogar der Strahlenresistenz, macht sie deshalb zu einem zunehmend wichtigeren Werkzeug, vor allem in der pharmazeutischen Industrie, aber auch in der Kosmetikindustrie oder bei der Registrierung, Evaluierung und Authorisierung von Chemikalien (REACH).

Einer breiten Verwendung großer Mengen von uniformen 3D-Zellaggregaten in Standardformaten für Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen standen in der Vergangenheit die bis dahin zur Verfügung stehenden Herstellungstechniken für solche Aggregate im Wege. Diese stützen sich im Wesentlichen auf solche Techniken, die die Zellen untereinander ohne Gerüststrukturen aggregieren oder sogenannte ‚Scaffolds‘ nutzen. Zu Ersteren zählen alle Verfahren, die zu kugeligen Aggregaten, sog. Sphäroiden, führen, während alle anderen Matrices nutzen, die die Zellen vollständig einschließen, wie beispielsweise Hydrogele, oder an / in denen die Zellen dreidimensional adhärieren können, wie Faser- und schwammartige Strukturen bzw. poröse Beads. Allen Methoden ist aber gemein, dass sie nur eingeschränkt für die Herstellung großer Mengen (>1000 Aggregate pro Ansatz) einsetzbar sind.

Polymerfolien als Basis eines neuartigen 3D-Zellkultursystems
Eine neue Methode, um nicht nur große Mengen an Aggregaten (>16.000 pro Mikrotiterplatte) herstellen zu können, sondern auch noch die Aggregatgröße zu kontrollieren und, vor allem, die Position jedes einzelnen Aggregats zu kennen, bietet das sogenannte Mikrothermoformen, dessen SMART-Variante (Surface Modification And Replication by Thermoforming) 2005 von uns patentiert wurde.

Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich Polymerfolien von typischerweise einigen zehn Mikrometern Dicke in Geometrien zu verstrecken, die im einfachsten Fall halbkugelförmig sind, aber prinzipiell sehr variabel in der Form sein können (Abb. 1a,b) [1-3]. Dabei ist deren Größe an physiologische Größenordnungen angelehnt. So beträgt die mittlere, freie Weglänge von Sauerstoff zwischen zwei Kapillaren in einem typischen tierischen Gewebe bis zu 300 µm, d.h. auf dieser Distanz findet eine Versorgung des Gewebes ausschließlich durch Diffusion statt. Die geformten Mikrokavitäten besitzen deshalb häufig einen Durchmesser von 300 µm und, je nach Anwendung, eine Tiefe von bis zu 300 µm, so dass eine stationäre Kultur von darin kultivierten dreidimensionalen Aggregaten auch ohne aktive Medienversorgung gestaltet werden kann.

Dabei lässt sich die Anzahl der Mikrokavitäten pro Well z.B. einer 96- oder 384-Well-Mikrotiterplatte variabel einstellen, um entweder Ultra-Hochdurchsatz-fähige Systeme herzustellen (10.000 Mikrokavitäten mit 40 µm Durchmesser pro Well im 96-Well-Format für Single-Cell-Applikationen) oder solche, für deren Kultivierung auch weniger zahlreiche Zellspezies, wie Stammzellen, in 3D-Aggregate überführt werden müssen (10 Kavitäten pro Well mit einem Durchmesser von 300 µm pro Well im 96-Well-Format). Da von 3D-Aggregaten häufig automatisiert konfokal z-Stapel für die Analyse zellulärer Ereignisse aufgenommen werden, werden aber gleichzeitig riesige Datenmengen generiert, die mit geeigneten Mitteln verarbeitet werden müssen.

Wir haben deshalb eine Plattform entwickelt, die die Möglichkeit der Generierung und Analyse von 960 oder 16.224 3D-Aggregaten im 96-Well-Format bietet (Abb. 2). Die dabei zur Verwendung kommenden Polymere können vielfältig sein, sind aber häufig das aus der Standard-Zellkultur bekannte Polystyrol oder Polycarbonat. Die Kunststoffe können entweder als für Zellen adhärent oder nicht-adhärent ausgeführt werden. Die Ultra-Low-Attachment-Oberflächen können dann zur klassischen Generierung von Sphäroiden genutzt werden, die entweder anschließend in der Platte einer Testung unterworfen und mikroskopiert oder aus der Platte gewonnen und allen gängigen Downstream-Analysen, wie RNA- oder Proteinisolierung unterzogen werden können. Im adhärenten Fall bilden die in den Kavitäten befindlichen Zellen sozusagen adhärente Sphäroide, deren äußere Zellen am Polymer der Mikrokavität haften. Die Adhäsion der Zellen kann durch Oberflächenmodifikationen, die einfach aus der Flüssigphase oder durch andere Techniken realisiert werden, unterstützt werden. Derart kultivierte Aggregate sitzen sehr fest in den Mikrokavitäten und können in der Regel nicht unbeabsichtigt durch z. B. einen Mediumwechsel ausgewaschen werden (Abb. 3).

Ein weiterer Vorteil der Mikrokavitätentechnik ist die Anordnung der Mikrokavitäten in definierten geometrischen Mustern. Dies führt zu sich selbst referenzierenden Positionen aller restlichen Kavitäten, sobald beispielsweise zwei Eckpositionen bekannt sind. Die Position ist somit eindeutig bestimmt und führt während Langzeituntersuchungen zu einem schnellen Wiederauffinden der entsprechenden Mikrokavität. Damit entfallen sowohl initial, als auch in Langzeituntersuchungen, die „Suchzeiten“ für 3D-Aggregate, die erheblich zur Gesamt-Screeningzeit beitragen.

Anwendungsgebiete
Typische Applikationsgebiete für diese Screening-Systeme sind alle Arten von toxikologischen Kurz- und Langzeitstudien, Wirkstoffmetabolismus- und Pharmakokinetikstudien (DMPK), in vitro-Modellentwicklungen, die Stammzellforschung oder die Krebsforschung, aber natürlich auch Anwendungen aus dem Grundlagenforschungsbereich wie die Entwicklung artifizieller Stammzellnischen. Im letztgenannten Bereich konnten wir vor Kurzem zeigen, dass mit Hilfe von Mikrokavitäten-Array-Bioreaktoren humane, hämatopoëtische Stammzellen in Co-Kultur mit humanen, mesenchymalen Stammzellen ihre Plastizität nach einer 14-tägigen Kultur im System nahezu vollständig behalten, wie anhand von Genexpressionsprofilen mittels RT2-PCR, Western Blots und Colony-Forming-Unit-Assays demonstriert werden konnte [4].

In Abbildung 4 sind Ausschnitte eines Screens zu sehen, der die Homogenität der 3D-Aggregate in den Mikrokavitäten, die regelmäßige Anordnung und die gute Mikroskopierbarkeit zeigen. Im gezeigten Screen sind Zellen und ihre Reaktion auf Hypoxie evaluiert worden. Grün angefärbt sind durch Hypoxie veränderte cytoplasmatische Proteine sowie der Zellkern (blau). In einem weiteren Screen konnte erfolgreich gezeigt werden, dass embryonale Stammzellen der Maus in Mikrokavitäten-Arrays schneller und besser (Zentrizität, Zirkularität) 3D-Aggregate formten, sowie dass das System für das Screening von gerichteter Differenzierung und des Effekts eines cAMP-Regulators erfolgreich eingesetzt werden kann [5].

Das Mikrothermoform- bzw. SMART-Verfahren verfügt über ein großes Potenzial, so dass neben den Anwendungen in der Zellbiologie auch an Anwendungen in völlig neuen Gebieten gedacht werden kann.

Autoren
Eric Gottwald1, Stefan Giselbrecht2, Roman Truckenmüller2
1Karlsruher Institut für Technologie, Institut für Biologische Grenzflächen-5, Karlsruhe
2Universität Maastricht, MERLIN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine, Department of Complex Tissue Regeneration, Maastricht, Niederlande

Literatur:
1. S. Giselbrecht, T. Gietzelt, E. Gottwald, C. Trautmann, R. Truckenmüller, K. F. Weibezahn, A. Welle: 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev., 2006. 8: p. 191-199.DOI: 10.1007/s10544-006-8174-8
2. R. Truckenmüller, S. Giselbrecht, N. Rivron, E. Gottwald, V. Saile, A. van den Berg, M. Wessling, C. van Blitterswijk: Thermoforming of film-based biomedical microdevices. Adv Mater, 2011. 23(11): p. 1311-29. DOI: 10.1002/adma.201003538
3. S. Giselbrecht, M. Reinhardt, T. Mappes, M. Börner, E. Gottwald, C. van Blitterswijk, V. Saile, R. Truckenmüller: Closer to nature-bio-inspired patterns by transforming latent lithographic images. Adv Mater, 2011. 23(42): p. 4873-9. DOI: 10.1002/adma.201102759
4. P. Wuchter, R. Saffrich, S. Giselbrecht, C. Nies, H. Lorig, S. Kolb, A. D. Ho, E. Gottwald: Microcavity arrays as an in vitro model system of the bone marrow niche for hematopoietic stem cells. Cell Tissue Res, 2016. 364(3): p. 573-584. DOI 10.1007/s00441-015-2348-8
5. E. J. Vrij, S. Espinoza, M. Heilig, A. Kolew, M. Schneider, C. A. van Blitterswijk, R. K. Truckenmüller, N. C. Rivron: 3D high throughput screening and profiling of embryoid bodies in thermoformed microwell plates. Lab Chip, 2016. 16(4): p. 734-42.DOI: 10.1039/c5lc01499a

Kontakt
Eric Gottwald
Karlsruher Institut für Technologie
Institut für Biologische Grenzflächen-5,
Eggenstein-Leopoldshafen
eric.gottwald@kit.edu

Mehr zum Thema Zellkultur: http://www.git-labor.de/category/tags/zellkultur
Chemgapedia High Throughput Screening: http://www.chemgapedia.de/

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