Neue Antibiotika: NMR-Spektroskopie am Limit

  • Abb. 1: Phasen der bakteriellen Transkription. (1) core- RNAP bindet σ-Faktor, das Holoenzym erkennt spezifisch DNA-Promotorregionen. (2) Der DNA-Doppelstrang wird aufgespalten und die RNASynthese beginnt. (3) σ-Faktor dissoziiert, die Elongation wird durch Transkriptionsfaktoren reguliert. (4) RNAP erreicht ein Terminationssignal, die RNA-Synthese wird beendet, alle Komponenten freigesetzt; RNAP steht für einen neuen Zyklus zur Verfügung.Abb. 1: Phasen der bakteriellen Transkription. (1) core- RNAP bindet σ-Faktor, das Holoenzym erkennt spezifisch DNA-Promotorregionen. (2) Der DNA-Doppelstrang wird aufgespalten und die RNASynthese beginnt. (3) σ-Faktor dissoziiert, die Elongation wird durch Transkriptionsfaktoren reguliert. (4) RNAP erreicht ein Terminationssignal, die RNA-Synthese wird beendet, alle Komponenten freigesetzt; RNAP steht für einen neuen Zyklus zur Verfügung.
  • Abb. 1: Phasen der bakteriellen Transkription. (1) core- RNAP bindet σ-Faktor, das Holoenzym erkennt spezifisch DNA-Promotorregionen. (2) Der DNA-Doppelstrang wird aufgespalten und die RNASynthese beginnt. (3) σ-Faktor dissoziiert, die Elongation wird durch Transkriptionsfaktoren reguliert. (4) RNAP erreicht ein Terminationssignal, die RNA-Synthese wird beendet, alle Komponenten freigesetzt; RNAP steht für einen neuen Zyklus zur Verfügung.
  • Abb. 2: NMR-Spektroskopie der RNAP. (A) C-H-Korrelationsspektren der Ile-, Val-, Leu-methylgruppenmarkierten RNAP, schwarz, und der ebenso markierten β’-Untereinheit in rekonstituierter RNAP (alle weiteren Untereinheiten deuteriert, grün) [1]. (B) Modell des Komplexes aus Thermus thermophilus RNAP (protein data bank (PDB)-Code: 2O5I; a1-Untereinheit, dunkelgrau; a2-Untereinheit, hellgrau; β-Untereinheit, grün, β’-Untereinheit, hellblau; ω-Untereinheit, hellbraun) und dem Transkriptionsfaktor NusA (NusA N-terminale Domäne (NTD), blau (PDBCode 2KWP); NusA-SKK-Domäne, dunkelblau (PDB-Code: 1L2F). Proteine in Oberflächendarstellung, DNA, schwarz; RNA, rot (graue Linie: mögliche Position der RNA). Das Modell resultiert aus einer docking-Simulation mit NMR-Titrationsdaten. Die RNAP-Bindungsfläche auf NusA-NTD ist violett gefärbt [2].
  • Abb. 3: NMR-Gerätezentrum des Lehrstuhls Biopolymere der Universität Bayreuth mit dem weltweit ersten 1 GHz-Spektrometer mit abgeschirmten Magneten (Mitte). Links, 600 MHz- und 700 MHz- Spektrometer; rechts, 900 MHz-Spektrometer.

Wie könnten Antibiotika aussehen, gegen die Bakterien nicht resistent werden? Fortschritte in der magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie an sehr großen Systemen erlauben neue Einblicke in die Regulation der bakteriellen Transkription, einem möglichen Angriffspunkt für innovative Wirkstoffe.

„Die Antibiotika gehen uns aus!“
Ärzte und Wissenschaftler warnen, dass die Abwehr von Bakterien immer schwieriger wird. Multiresistente Mikroben, die oft auch als Krankenhauskeime in Erscheinung treten, sind mittlerweile eine häufige Todesursache, obwohl die Einführung von Antibiotika Mitte des 20sten Jahrhunderts die Zahl der durch Infektionen herbeigeführten Todesfälle zunächst drastisch reduziert hat. Penicillin, das erste verfügbare Antibiotikum, stört den Aufbau der Zellwände von Bakterien. Nach Penicillin wurden neue Antibiotika mit anderen Wirkmechanismen entdeckt und entwickelt. Allerdings wurden praktisch alle Klassen an Antibiotika, die heute verfügbar sind, in den 30 Jahren unmittelbar nach Beginn der „antibiotischen Ära“ eingeführt. Viele Wirkstoffe haben wie Penicillin die bakterielle Zellwand als Ziel, andere unterbrechen die Produktion von bakteriellen Proteinen oder sie verhindern die Replikation von DNA. Aufgrund ihrer genetischen Flexibilität, ihrer hohen Populationsdichte und ihrer schnellen Generationenfolge können Bakterien durch natürliche Selektion die für sie tödlichen Effekte von Antibiotika überwinden: Sie werden resistent. Die falsche und übermäßige Nutzung von Antibiotika fördert diese Entwicklung und führt zu multiplen Resistenzen, neue Wirkstoffe fehlen. Laut der Weltgesundheitsorganisation droht uns wegen des Fehlens neuer Antibiotika eine Rückkehr in die „prä-antibiotische Ära“ mit unkontrollierbaren Infektionen.
Die Entwicklung neuer Wirkstoffe, die gezielt grundlegende Prozesse im bakteriellen Lebenszyklus unterbrechen, erfordert das Verständnis dieser Prozesse auf molekularer Ebene, sowie die Kenntnis der Unterschiede zu analogen Prozessen im Menschen.

Neue Ziele für neue Wirkstoffe
Solch ein grundlegender Prozess ist die Transkription, d. h.

die Übersetzung der in DNA gespeicherten Erbinformation in RNA durch das Enzym RNA-Polymerase (RNAP). Dieser Prozess ist hoch komplex und wird durch eine Vielzahl an weiteren bakteriellen Proteinen exakt reguliert (Abb. 1). Die räumlichen Strukturen vieler an der Transkription beteiligter Moleküle sind zwar bekannt, Details der Regulation sind aber noch wenig verstanden. Die Transkriptionsregulation beruht auf fein abgestimmten Dynamikphänomenen, schnellen Konformationsänderungen und transienten Interaktionen. Röntgenstrukturanalyse und Elektronenmikroskopie, die bisherigen Hauptuntersuchungsmethoden der RNAP, liefern nur Momentaufnahmen der Ereignisse. Für die Untersuchung dynamischer Prozesse auf molekularer und atomarer Ebene ist die magnetische Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR)-Spektroskopie die Methode der Wahl. Allerdings ist diese Technik durch die Proteingröße limitiert, so dass sie im Allgemeinen nur für kleine und mittelgroße Proteine angewandt wird.

NMR-Spektroskopie
Die NMR-Spektroskopie untersucht Atome und deren Wechselwirkung. Seit ihrer Entdeckung 1945 ist ihre Bedeutung in Chemie und Biologie ständig gestiegen. Heute ist die NMR-Spektroskopie eine der Kerntechniken zur Aufklärung der räumlichen Strukturen von Biomakromolekülen und zur Untersuchung von dynamischen Prozessen in und zwischen diesen Molekülen. Grundlage der NMR ist die Wechselwirkung des magnetischen Moments von Atomkernen mit einem äußeren Magnetfeld, die die Kerne in verschiedene Energieniveaus bringt, zwischen denen durch Einstrahlen von Radiowellen der richtigen Frequenz Übergänge induziert werden können (Resonanzphänomen). Diese Frequenzen sind von der elektronischen Umgebung des beobachteten Kerns und weiteren molekularen Parametern abhängig. In der NMR-Spektroskopie werden umgekehrt diese Resonanzfrequenzen gemessen und Rückschlüsse auf strukturelle Eigenschaften der beobachteten Biomakromoleküle gezogen. Es sind nur solche Atomkerne (Isotope) beobachtbar, deren magnetisches Moment ungleich Null ist. Die in der Chemie und Biologie wichtigsten detektierbaren Isotope, die Wasserstoffkerne, sind nicht radioaktiv, genauso wenig wie die seltenen Kohlenstoff- und Stickstoffisotope 13C und 15N sowie Deuteronen, die sehr oft zur Markierung und zur Signalunterdrückung bei NMR-Experimenten eingesetzt werden. Diese nicht-radioaktiven Markierungen werden molekularbiologisch vorgenommen und erlauben die Untersuchung auch von größeren Proteinen. Verbesserte Markierungsverfahren sowie Fortschritte in Spektrometerbau und Messtechnik erlauben mittlerweile die Untersuchung von Systemen der Größenordnung 100 kDa.

NMR-Spektroskopie diesseits der Nanoskala
Bislang konnten nur sehr wenige Systeme mit einer Molekülmasse > 100 kDa mittels NMR-Spektroskopie sinnvoll und erfolgreich untersucht werden. Für molekulare Systeme dieser Größenordnung werden spezielle Techniken angewandt, bei denen die Methylgruppen bestimmter Aminosäuren (z. B. Leu, Val, Ile) [1H, 13C] markiert und alle Protonen außerhalb dieser Methylgruppen durch Deuteronen ersetzt werden. Die markierten Gruppen sind dann trotz der Proteingröße beobachtbar und dienen als NMR-aktive Sonden. Der Arbeitsgruppe um Paul Rösch und Stefan Knauer an der Universität Bayreuth ist es gelungen, die RNAP, obwohl sie aus heteromeren Untereinheiten mit einer Gesamtmasse von 400 kDa zusammengesetzt ist, der NMR-Spektroskopie zugänglich zu machen.

Die Wissenschaftler konnten die Methodik der Methylgruppenmarkierung auf die RNAP übertragen (Abb. 2A) und gleichzeitig deren fünf Untereinheiten einzeln herstellen, individuell markieren und anschließend das Gesamtprotein in aktiver Form zusammenzusetzen [1]. Auf diese Weise konnten auch spezifisch einzelne Untereinheiten innerhalb der intakten RNAP beobachtet werden (Abb. 2A) [1]. Diese Arbeiten stellen die Grundlage dar, um zu untersuchen, welche strukturellen Auswirkungen die Wechselwirkung mit Regulationsfaktoren auf die RNAP hat.

Mit relativ einfachen Experimenten konnten die Wissenschaftler dann diejenigen RNAP-Untereinheiten identifizieren, an die bestimmte Transkriptionsfaktoren binden, und die Kontaktflächen zwischen verschiedenen Transkriptionsfaktoren und der RNAP bestimmen [1,2]. So konnten Transkriptionsfaktor: RNAP-Komplexe modelliert werden, was wiederum Schlüsse auf die regulatorische Funktion der Transkriptionsfaktoren erlaubt (Abb. 2B). Künftig wollen die Wissenschaftler diese Untersuchungen auf Komplexe der RNAP mit mehreren Transkriptionsfaktoren gleichzeitig erweitern.

Resultate konventioneller NMR-Experimente und bereits veröffentlichte Erkenntnisse der Arbeitsgruppe über das Zusammenspiel von Transkription und Proteinbiosynthese ergänzen zusammen mit diesen neuen Ergebnissen das bisherige Bild von bakteriellen Regulationsprozessen. Langfristig soll so die Basis für die Entwicklung neuer Wirkstoffe geschaffen werden, die gezielt bestimmte Prozesse im bakteriellen System stören, das menschliche aber unbeeinflusst lassen.
Diese neu etablierten Methoden lassen sich selbstverständlich auch allgemein auf Systeme übertragen, bei denen ein kleineres Protein an einen supramolekularen Partner bindet, etwa die Wechselwirkung von Vesikeln mit Rezeptorbruchstücken oder Allergenen.

Das 1 GHz-Spektrometer
Die Arbeiten an der RNAP zeigen, dass sich die Stärken der NMR-Spektroskopie, nämlich die Untersuchung von molekularen Interaktionen und molekularer Dynamik, auch auf sehr große Molekülkomplexe anwenden lassen. Ein Durchbruch bei der Erforschung dieser hochmolekularen Komplexe ist die Installation des weltweit ersten 1 GHz-Spektrometers mit abgeschirmtem Magneten am Lehrstuhl Biopolymere der Universität Bayreuth, die in diesem Frühjahr abgeschlossen wird (Abb. 3). Die Wissenschaftler erwarten von dieser Neuinstallation deutlich umfassendere Informationen über die Wechselwirkung sehr großer, biomolekularer Systeme und damit eine breitere Basis zur Entwicklung gezielt wirkender, effizienter und Resistenzen vermeidender Antibiotika.

Danksagung
Diese Arbeiten wurden durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Ro 617/21-1, P. Rösch) und den Ludwig-Schaefer-Award 2015 des Columbia University Medical Center (P. Rösch) unterstützt.

Referenzen
[1] Johanna Drögemüller, Martin Strauß, Kristian Schweimer, Birgitta M. Wöhrl, Stefan H. Knauer & Paul Rösch: Exploring RNA polymerase regulation by NMR spectroscopyScientific Reports A 5:10825 (2015) doi: 10.1038/srep10825
[2] Johanna Drögemüller, Martin Strauß, Kristian Schweimer, Marcel Jurk, Paul Rösch & Stefan H. Knauer: Determination of RNA polymerase binding surfaces of transcription factors by NMR spectroscopyScientific Reports B 5:16428 (2015) doi: 10.1038/srep16428

Autoren
Stefan Knauer1 und Paul Rösch1

Zugehörigkeiten
1 Universität Bayreuth, Lehrstuhl  Biopolymere, Bayreuth

Kontakt
Dr.  Stefan Knauer

Universität Bayreuth
Lehrstuhl  Biopolymere
Bayreuth

Weitere Beiträge zu Antibiotika: http://www.git-labor.de/category/tags/antibiotika
Mehr zur NMR Spektroskopie: http://www.git-labor.de/category/tags/nmr

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