Referenzbibliotheken im Screening-Alltag

Erzeugung und Anwendung von Chromatographie-Datenbanken

  • Abb. 1: Extrahierte Ionenchromatographie der identifizierten JWH-250-Metaboliten in einer authentischen Patienten-Urinprobe mittels des MWW-Screening-Verfahrens.Abb. 1: Extrahierte Ionenchromatographie der identifizierten JWH-250-Metaboliten in einer authentischen Patienten-Urinprobe mittels des MWW-Screening-Verfahrens.
  • Abb. 1: Extrahierte Ionenchromatographie der identifizierten JWH-250-Metaboliten in einer authentischen Patienten-Urinprobe mittels des MWW-Screening-Verfahrens.
  • Tab. 1: ToxID-Ergebnisliste der Analyse einer authentischen Patienten-Urinprobe anhand der MWW-Referenzbibliothek.

Das Screening von Drogen und Giften in verschiedenen biologischen Untersuchungsmaterialien ist auf dem Gebiet der klinischen und forensischen Toxikologie, wie auch im Bereich der Dopingkontrolle, nach wie vor eine Herausforderung. Mehrere Immunoassays und kombinierte Chromatographie-Massenspektrometrie-Methoden sind entweder für gezielte Analysen oder für umfassende Screening-Verfahren [1-3] fest etabliert.

Massenspektrometrie und Referenzdatenbanken

Seit Einführung der Massenspektrometrie in die Klinische und Forensische Toxikologie vor rund 40 Jahren ist sie heute zur Methode der Wahl geworden. Sie bietet gekoppelt an Gaschromatographie, Flüssigchromatographie oder Kapillarelektrophorese die höchste Flexibilität, Spezifität und Sensitivität in der qualitativen wie quantitativen Anwendung. Die hohe Spezifität basierend auf charakteristischen und reproduzierbaren Fragmentierungen erlaubt, mittels Referenzspektren unbekannte Verbindungen zu identifizieren. In der Toxikologie müssen die entsprechenden Referenz-Bibliotheken neben den Substanzen selbst auch deren Abbauprodukte (Metaboliten) umfassen, da diese z.T. ausschließlich oder zusätzlich in Körperflüssigkeiten gefunden werden. Im letzteren Fall, erhöhen sie die Sicherheit eines positiven Befundes.

Screening

Im Gegensatz zu gezielten Analysen, die einzelne oder nur wenige Analyten abdecken, berücksichtigen umfassende Screening-Verfahren bis zu mehrere tausend unterschiedliche Verbindungen in einer einzigen Analyse. Daher zählen umfassende Screening-Verfahren zu den wichtigsten Analysetechniken auf dem Gebiet der klinischen und forensischen Toxikologie und bilden den Grundpfeiler einer systematischen toxikologischen Analyse (STA) [1-3].

Betrachtet man verschiedene Untersuchungsmaterialien wie Speichel, Plasma/Serum und Urin, so lässt sich feststellen, dass die Anforderungen an umfassende Screening-Verfahren unterschiedlich sind. Während das Screening nach Drogen und Giften in Plasma/Serum hoher analytischer Sensibilität bedarf, muss das Screening in Urinproben auch Metaboliten von Drogen und Giften abdecken, da die meisten dieser Substanzen mit dem Urin als Metaboliten [4] ausgeschieden werden.

Durch die Entwicklung kombinierte Techniken wie Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-MS) und Liquid-Chromatographie-Massenspektrometer (LC-MS) sind heute analytische Methoden verfügbar, die sowohl eine hohe analytische Sensibilität als auch eine sichere Identifikation für den eindeutigen Nachweis durch Referenzspektren-Bibliotheken [1-3,5] gewährleisten.

Da Urin aufgrund seiner nicht-invasiven Gewinnbarkeit und seines breiten Nachweisfensters die bevorzugte biologische Matrix für den Nachweis von Drogen und Giften ist, wurde im Laufe der letzten Jahrzehnte umfassende auf Metaboliten basierte Screening-Verfahren mit GC-MS und LC-MS [6-13] entwickelt.

In diesem Artikel werden das allgemeine Verfahren zur Erzeugung von Metabolit-Referenzspektren, GC-MS- und LC-MS-Referenzbibliotheken und zwei exemplarische Anwendungen der beiden Referenzbibliotheken beschrieben.

Erzeugung von Referenz-Massenspektren

Verschiedene Substanzen wurden mehreren männlichen Wistar-Ratten in einer Einmaldosis von 20 mg/kg Körpermasse oder entsprechend einer üblichen Dosierung in wässriger Suspension per Magensonde zu toxikologisch-diagnostischen Zwecken gemäß dem dafür geltenden deutschen Recht verabreicht.

Der Urin wurde über einen 24-Stunden-Zeitraum getrennt von Fäzes gesammelt und mit Natriumfluorid stabilisiert. Vor der Verabreichung der Droge wurden Urin-Blindproben entnommen, um diese jeweils auf das Vorhandensein interferierender Substanzen zu prüfen. Anschliessend wurde jeweils eine Flüssig-Flüssig-Extraktion, eine Festphasenextraktion und eine Eiweißausfällung vor der Abspaltung und/oder ohne chemische und enzymatische Abspaltung von Phase-II- Metaboliten mit allen Urinproben durchgeführt. Die jeweiligen Extrakte wurden direkt oder nach Derivatisierung (Acetylierung, Methylierung, Trimethylsilylierung, Trifluoroacetylierung, Pentafluorpropionylierung und/oder Heptafluorbutyrylierung) per GC-MS und LC-MS analysiert. Drogenabbauprodukte wurden von qualifizierten Fachkräften nachgewiesen und beschrieben. Die entsprechenden Referenzspektren wurden erstellt und in den GC-MS- und LC-MS-Bibliotheken [6-8,10-13] hinterlegt.

Referenzbibliotheken

GC-MS
Das GC-MS-Verfahren und die Referenzbibliothek wurden erstmalig von Maurer et al. im Jahre 1985 [14] beschrieben. Mittlerweile wurde die Referenzbibliothek mehrmals aktualisiert und erweitert. Die neue Version 2016 der Referenzdatenbank (Mass Spectral Library of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants, and Metabolites; Maurer, Pfleger, Weber; „MPW-Bibliothek”) umfasst 10.320 Spektren, darunter über 7.600 Datensätze von Metaboliten, über 4.200 von acetylierten, über 1.500 von methylierten, über 1.500 von trimethylsilylierten, über 1.000 von trifluoracetylierten, über je 1.500 von pentafluorpropionylierten oder heptafluorbutyrylierten Verbindungen [6]. Alle Datensätze umfassen außerdem per Computer suchbare chemische Strukturen (Verknüpfungstabelle), das Elektronenstoß-Spektrum und andere verbindungsspezifische Eigenschaften wie etwa den Retentionsindex.

LC-MS
Das LC-MS-Verfahren zum Metabolit-Screening wurde erstmalig von Wissenbach et al. 2011 [7,15-17] beschrieben. Die aktuelle Version [7] umfasst >10.000 Referenzspektren (MS2 und MS3) von 1.500 toxikologisch relevanten Substanzen, 3.000 entsprechenden Metaboliten und 50 endogenen Molekülen. Die geräteübergreifende Nutzbarkeit von MWW-Referenzspektren wurde für verschiedene Hersteller und Geräte nachgewiesen [17,18]. Eine aktualisierte und erweiterte Version dieser Referenzbibliothek erscheint 2016 [9].

Anwendungen

GC-MS
In einer von Meyer et al. durchgeführten Studie wurde die Verwendung einer Software für automatische Dekonvolution auf ihre Eignung beim Screening ohne Anfangsverdacht getestet, und ein Vergleich mit manueller und softwareunterstützter Datenauswertung angestellt. Anschliessend wurden die Softwareparameter für die Verwendung der MPW-Referenzbibliothek bei menschlichem Urin optimiert. Das Ziel der Studie bestand in der Beschleunigung des Auswertungsprozesses und des Bibliotheksabgleichs der aufgezeichneten Vollscan-GC-MS-Spektren [7,19].

Probenaufbereitung und Analyse

Einhundertelf authentische Patienten-Urinproben wurden durch Säurehydrolyse, Flüssig-Flüssig-Extraktion und Acetylierung aufbereitet, wie von Maurer et al. [20] beschrieben. Die Analyse wurde an einem Quadrupol-GC-MS-Gerät im Vollscan-Modus bei -70 eV Elektronen-Ionisation und 20 min Laufzeit durchgeführt [20].

Datenauswertung

Die vom GC-MS-System erfassten Vollscan-Daten wurden fachmännisch auf die Gegenwart von Peaks und Massenspektren von (derivatisierten) Drogen, Metaboliten und Artefakten untersucht. Daher folgte auf das manuelle Screening des Totalionenchromatogramms (TIC) ein Screening nach den einzelnen Drogenklassen durch extrahierte Ionenchromatogramme (EIC), wie von Maurer et al. beschrieben. Die identischen GC-MS-Datensätze wurden dann mit dem kostenlos verfügbaren automatischen Massen-Dekonvolutions- und Identifikationssystem (AMDIS) analysiert [19]. Die mit AMDIS erzielten Treffer wurden von einem erfahrenen Toxikologen geprüft und verifiziert. In allen Fällen gelang die Identifikation durch computerunterstützten Vergleich der zugrunde gelegten Massenspektren mit jenen der MPW-Referenzbibliothek. Die endgültige Entscheidung darüber, ob ein Bibliotheksfund wirklich ein „echter Treffer“ war, fällte stets ein erfahrener Toxikologe.

Vergleich

Ein Vergleich der Ergebnisse manueller Datenauswertung und optimierter AMDIS-Einstellungen ergab eine hohe Übereinstimmung bei beiden Auswertungsmethoden. Lediglich einmal führte die manuelle Auswertung zu einem zusätzlichen „echten Treffer” (Phenobarbital) über die AMDIS-Ergebnisse hinaus. Andererseits identifizierte AMDIS weitere Zielsubstanzen in 15 Proben. Auch wenn die meisten dieser Ergebnisse sich auf kleinere (Metaboliten-)Peaks bezogen und aus notfalltoxikologischer Sicht nicht relevant waren, zeigte diese Vergleichsstudie doch, dass AMDIS eine nützliche ergänzende Datenauswertungsmethode für die GC-MS-Analyse ist. Und dies vor allem, weil der Auswertungsprozess durch die Verwendung von automatischen Datenauswertungen um den Faktor 2,5 beschleunigt wurde.

Meyer et al. konnten zeigen, dass die automatische Software-Dekonvolution für das MPW-Screening-Verfahren z.B. im Urin genutzt werden kann, und empfahlen den Einsatz von AMDIS zusätzlich zur manuellen Spektrenauswertung [19]. Eine ähnliche Studie über das GC-MS-Blutscreening mit AMDIS und MPW wurde jüngst vorgestellt [21].

LC-MS

In den Studien von Wissenbach et al. [16] wurde das MWW-Bibliothek-Screening-Verfahren im Hinblick auf die Aspekte Recovery (RE), Matrix-Effekte (ME), Prozesseffizienz (PE) und Nachweisgrenzen (Limits of detection, LOD) für ausgewählte Suchtdrogen beschrieben. In einem zweiten Schritt wurden Urinscreening-Ergebnisse anhand des GC-MS-MPW-Verfahrens mit jenen verglichen, die sich beim LC-MS-MWW-Screening ergaben [7].

Probenaufbereitung und Analyse

Zur Bestimmung der Analyseparameter wurden Urinproben mit 16 verschiedenen Suchtmitteln versetzt (darunter auch Phase-I- und Phase-II-Metaboliten). Des Weiteren wurden RE, ME, PE und LOD nach den Richtlinien bestimmt.

Für die Vergleichsstudie wurden 500 authentische Patienten-Urinproben, die für Routine-Drogentests abgegeben wurden, mit GC-MS und LC-MS anhand der MPW-bzw. MWW- Referenzbibliothek gescreent.

Alle Urinproben wurden mit Acetonitril ausgefällt, verdampft und resuspendiert, [7,15,16]. Die LC-MS-Analyse erfolgte an einer linearen Ionenfalle anhand von Daten aus MS1 Vollscan, MS2 und MS3 Ionenerfassung in einer 25-minütigen Chromatographie, wie für die MWW-Referenzbibliothek [7] beschrieben. Die LCQuan Software kam zur Bestimmung von RE, ME und PE bei der Bestimmung der Analyseparameter zum Einsatz, während die ToxID Software zur Treffersuche bei allen erfassten LC-MS-Proben mit LOD-und Screening-Ergebnissen verwendet wurde [15].

Ergebnisse

Hinsichtlich RE, ME, PE und LOD zeigte die MWW-Screening-Verfahren-Probenaufbereitung gute Ergebnisse und erwies sich als für die STA [15] geeignet. Wie in Tabelle1 beispielhaft dargestellt, wurden verschiedene Metaboliten über ein breites Spektrum von Retentionszeiten in einer authentischen Urinprobe nachgewiesen. Dies erbrachte den eindeutigen Nachweis einer Drogeneinnahme, selbst in Fällen bei denen ME den Nachweis in bestimmten chromatographischen Retentionszeitfenstern erschwerten.

Durch den Vergleich von GC-MS-MPW- mit LC-MS-MWW-Screening-Ergebnissen zeigte sich, dass beide Screening-Verfahren einander ergänzen, da beide jeweils spezifische Vor- und Nachteile haben [15]. Einerseits lieferte die LC-MS falsch-negative Ergebnisse bei manchen Proben, die niedrige und nicht relevante Konzentrationen (aus notfalltoxikologischer Sicht) von Diazepam, Lorazepam und/oder deren Metaboliten enthielten. Dies war auf die Probenaufbereitung für das GC-MS-Verfahren zurückzuführen, die eine Säurehydrolyse beinhaltet. So wurden Benzodiazepin-ähnliche Substanzen und ihre Metaboliten in das entsprechende Benzophenon überführt, während sie beim LC-MS-Verfahren in mehrere (kleinere) Peaks unterschiedlicher Phase-I- und -II-Metaboliten je nach der angewandten Probenaufbereitung aufgeteilt wurden [16].

Andererseits wurden Proben falsch-negativ auf synthetische Cannabinoide durch GC-MS gescreent, wohingegen das LC-MS-Screening-Verfahren diese Substanzen mittels der Metabolit-Referenzspektren, wie in Abbildung 1 veranschaulicht, nachweisen konnte.

Zusammenfassung

Wissenbach et al. zeigten in dieser und ähnlichen Studien [10-13,22-26], dass sich das MWW-Screening-Verfahren für verschiedenste Stoffklassen eignet, und kamen zu dem Schluss, dass das MWW-Screening-Verfahren eine hilfreiche Ergänzung zum etablierten GC-MS-Verfahren darstellt [15-17].

Fazit

Die kombinierte Massenspektrometrie unter Verwendung von metabolitbasierten Referenzbibliotheken stellt den Grundpfeiler der STA dar. Das MPW-GC-MS-Verfahren kommt seit mehreren Jahrzehnten verbreitet zum Einsatz und hat sich auf dem Gebiet der klinischen und forensischen Toxikologie und der Dopingkontrolle fest etabliert. Gegenwärtig steht die LC-MS-Analyse immer mehr im Fokus: Durch die Entwicklung der MWW-LC-MS-Bibliothek steuerten die Autoren ein ergänzendes Screening-Verfahren mit modernster LC-MS bei. Dementsprechend sind gegenwärtig beide Screening-Verfahren als Bestandteil der STA in mehreren Instituten auf dem Gebiet der klinischen und forensischen Toxikologie fest etabliert [10-13,22-32]. Überdies wurde das MWW-Screening-Verfahren auf anderen Gebieten wie der Pharmakoepidemiologie erfolgreich angewandt [33].

Ausblick

Neben der weiteren Verbreitung hochauflösender Massenspektrometer stehen Automatisierungen und Miniaturisierungen im Fokus der nächsten Zeit. Moderne Aufgabeverfahren ohne klassische chromatographische Trennung werden ihre Routinetauglichkeit zu beweisen haben.

Literaturhinweise

[1]    H.H. Maurer, Position of chromatographic techniques in screening for detection of drugs or poisons in clinical and forensic toxicology and/or doping control, Clin. Chem. Lab. Med. 42, 1310 (2004), DOI:10.1515/CCLM.2004.250

[2]    H.H. Maurer, Experientia 100 (2010) 317,

[3]    H.H. Maurer, What is the future of (ultra) high performance liquid chromatography coupled to low and high resolution mass spectrometry for toxicological drug screening?, J. Chromatogr. A 1292 19, (2013), DOI:10.1016/j.chroma.2012.08.069

[4]    R.C. Baselt, Disposition of toxic drugs and chemicals in man, Biomedical Publications, Foster City CA, 2009, ISBN 978-0-9626523-9-4

[5]    H.H. Maurer, Hyphenated mass spectrometric techniques-indispensable tools in clinical and forensic toxicology and in doping control, J. Mass Spectrom. 41 (2006) 1399,

[6]    H.H. Maurer, K. Pfleger and A.A. Weber, Mass Spectral Library of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites, Wiley-VCH, Weinheim, 2016.

[7]    H.H. Maurer, D.K. Wissenbach and A.A. Weber, Maurer/Wissenbach/Weber MWW LC-MSn Library of Drugs, Poisons, and their Metabolites, Wiley-VCH, Weinheim (Germany), 2014.

[8]    H.H. Maurer, A.G. Helfer, M.R. Meyer and A.A. Weber, Maurer/Helfer/Meyer/Weber MHMW LC-HR-MS/MS Library of Drugs, Poisons, and their Metabolites, in preparation, 2016.

[9]    H.H. Maurer, D.K. Wissenbach and A.A. Weber, Maurer/Wissenbach/Weber MWW LC-MSn Library of Drugs, Poisons, and their Metabolites, Wiley-VCH, Weinheim (Germany), 2016.

[10]    A.T. Caspar, A.G. Helfer, J.A. Michely, V. Auwaerter, S.D. Brandt, M.R. Meyer and H.H. Maurer, Studies on the metabolism and toxicological detection of the new psychoactive designer drug 2-(4-iodo-2,5-dimethoxyphenyl)-N-[(2-methoxyphenyl)methyl]ethanamine (25I-NBOMe) in human and rat urine using GC-MS, LC-MSn, and LC-HR-MS/MS, Anal. Bioanal. Chem. 407  6697, (2015), DOI:10.1007/s00216-015-8828-6

[11]    A.G. Helfer, A. Turcant, D. Boels, S. Ferec, B. Lelievre, J. Welter, M.R. Meyer and H.H. Maurer, Elucidation of the metabolites of the novel psychoactive substance 4-methyl-N-ethyl-cathinone (4-MEC) in human urine and pooled liver microsomes by GC-MS and LC-HR-MS/MS techniques and of its detectability by GC-MS or LC-MS(n) standard screening approaches, Drug Test. Anal. 7  368, (2015), doi/10.1002/dta.1682

[12]    G.M.J. Meyer, C.S.D. Wink, J. Zapp and H.H. Maurer, GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum,  Anal. Bioanal. Chem. 407 761, (2015), DOI:10.1007/s00216-014-8109-9

[13]    J. Welter, P. Kavanagh, M.R. Meyer and H.H. Maurer, Benzofuran analogues of amphetamine and methamphetamine: studies on the metabolism and toxicological analysis of 5-APB and 5-MAPB in urine and plasma using GC-MS and LC-(HR)-MS(n) techniques, Anal. Bioanal. Chem. 407  1371, (2015), DOI: 10.1007/s00216-014-8360-0

[14]    K. Pfleger, H. Maurer and A. Weber, Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, and their Metabolites, VCH publisher, Weinheim, 1985.

[15]    D.K. Wissenbach, M.R. Meyer, D. Remane, A.A. Weber and H.H. Maurer, Development of the first metabolite-based LC-MS(n) urine drug screening procedure-exemplified for antidepressants, Anal. Bioanal. Chem. 400  79, (2011), DOI:10.1007/s00216-010-4398-9

[16]    D.K. Wissenbach, M.R. Meyer, D. Remane, A.A. Philipp, A.A. Weber and H.H. Maurer, Drugs of abuse screening in urine as part of a metabolite-based LC-MSn screening concept, Anal. Bioanal. Chem. 400  3481, (2011), DOI:10.1007/s00216-011-5032-1

[17]    D.K. Wissenbach, M.R. Meyer, A.A. Weber, D. Remane, A.H. Ewald, F.T. Peters and H.H. Maurer, Towards a universal LC–MS screening procedure – can an LIT LC–MSn screening approach and reference library be used on a quadrupole-LIT hybrid instrument?, J. Mass Spectrom. 47 66, (2012), DOI:10.1002/jms.2027

[18]    B. Schneider, M. Meyer, A. Kiehne and C. Baessmann, Abstract book to the 52nd Annual Meeting of TIAFT, Buenos Aires, Argentina, November 9-13 (2014) 128.

[19]    M.R. Meyer, F.T. Peters and H.H. Maurer, Automated mass spectral deconvolution and identification system for GC-MS screening for drugs, poisons, and metabolites in urine, Clin. Chem. 56  575, (2010), DOI:10.1373/clinchem

[20]    H.H. Maurer, K. Pfleger and A.A. Weber, Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites, Wiley-VCH, Weinheim (Germany), 2011.

[21]    M. Grapp, H.H. Maurer and H. Desel, Drug Test. Anal (2015)

[22]    M.R. Meyer, A. Holderbaum, P. Kavanagh and H.H. Maurer, J. Mass Spectrom. (2015)

[23]    J.A. Michely, A.G. Helfer, S.D. Brandt, M.R. Meyer and H.H. Maurer, Anal Bioanal. Chem. 407 (2015) 7831.

[24]    J. Welter, S.D. Brandt, P. Kavanagh, M.R. Meyer and H.H. Maurer, Anal Bioanal. Chem. 407 (2015) 3457.

[25]    C.S.D. Wink, G.M.J. Meyer, J. Zapp and H.H. Maurer, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 1545.

[26]    C.S.D. Wink, M.R. Meyer, T. Braun, A. Turcant and H.H. Maurer, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 831.

[27]    J. Welter-Luedeke and H.H. Maurer, Ther. Drug Monit. (2015)

[28]    M.R. Meyer, C. Lindauer and H.H. Maurer, Toxicol. Lett. 225 (2014) 139.

[29]    M.R. Meyer, S. Mauer, G.M.J. Meyer, J. Dinger, B. Klein, F. Westphal and H.H. Maurer, Drug Test. Anal. 6 (2014) 746.

[30]    J. Welter, M.R. Meyer, P. Kavanagh and H.H. Maurer, Anal. Bioanal. Chem. 406 (2014) 1957.

[31]    J. Welter, P. Kavanagh and H.H. Maurer, Anal. Bioanal. Chem. 406 (2014) 3815.

[32]    C.S.D. Wink, G.M.J. Meyer, D.K. Wissenbach, A. Jacobsen-Bauer, M.R. Meyer and H.H. Maurer, Drug Test. Anal. 6 (2014) 1038.

[33]    H. Hoeke, S. Roeder, T. Bertsche, I. Lehmann, M. Borte, B.M. von and D.K. Wissenbach, Drug Test. Anal. (2014)

Kontakt
Prof. Dr. Dr. h.c. (UGent) Hans H. Maurer

Abteilung Experimentelle und Klinische Toxikologie
Universität des Saarlandes
Homburg/Saar, Germany

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