17.03.2016
ForschungUmwelt

Legionellenbestimmung in Kühlturmwässern

der Weg zu vergleichbaren Ergebnissen

  • Abb. 1: Schema (Ausschnitt) der Untersuchungsstrategie für die dreifaktorielle Varianzanalyse.Abb. 1: Schema (Ausschnitt) der Untersuchungsstrategie für die dreifaktorielle Varianzanalyse.
  • Abb. 1: Schema (Ausschnitt) der Untersuchungsstrategie für die dreifaktorielle Varianzanalyse.
  • Abb. 2: Durch Varianzanalyse ermittelte Streuungsanteile der einzelnen Faktoren.
  • Tab. 1: Ergebnisse der Untersuchung auf Legionellen

Mit der geplanten Umsetzung der VDI 2047 Blatt 2 ist bei Kühlturmwässern ein Grenzwert für Legionellen einzuhalten. Als äußerst problematisch erweist es sich, dass trotz Anwendung vorgegebener Normen zur Analytik auf Legionellen keine vergleichbaren und somit keine belastbaren Ergebnisse erhalten werden. Zur Ursachenaufklärung wurden mittels der Varianzanalyse die Einflussgrößen Probenteilung, Hitze-, Säurebehandlung und Direktansatz / Membranfiltrationsverfahren auf das Analysenergebnis quantifiziert und Schlussfolgerungen abgeleitet.

Legionellen können zu zwei Erkrankungsarten, als Legionellosen bezeichnet, führen. Das ist zum einen das Pontiac-Fieber, eine leicht verlaufende grippeähnliche Erkrankung ohne Lungenentzündung, die in der Regel ohne Behandlung ausheilt. Die andere Erkrankung, die Legionärskrankheit, beginnt grippeähnlich und führt innerhalb weniger Stunden zu schweren Lungenentzündungen. Ca. 5 – 10 % der Erkrankten sterben daran. Die Ansteckung erfolgt in der Regel durch Einatmen der erregerhaltigen Aerosole von empfänglichen Personen.

Die Kontrolle des Trinkwassers auf Legionellen ist in Deutschland durch die Trinkwasserverordnung geregelt [1].

Kühlturmwässer
Dass Legionellen auch in Kühlturmwässern eine Gesundheitsgefahr darstellen, ist seit dem Vorfall in Warstein 2013 mit zwei Todesfällen und 159 schwer Erkrankten deutliche Gewissheit geworden.

Seit Januar 2015 liegt der Weißdruck der VDI 2047 Blatt 2 Kühlturmregel [2] vor, die den hygienegerechten Betrieb von Rückkühlwerken beschreibt und deren Umsetzung durch eine Verordnung für Verdunstungskühlanlagen laut Bundes-Immissionsschutzgesetz unmittelbar bevor steht. Demnach hat der Betreiber einer Verdunstungskühlanlage den Stand der Technik, Arbeitsmedizin und Hygiene gemäß §4 des Arbeitsschutzgesetzes wahrzunehmen und zu erfüllen. Der Arbeitgeber ist verpflichtet, eine Gefährdungsbeurteilung zu erstellen. Der festgelegte Grenzwert für Legionellen orientiert sich am Trinkwasser, bereits geringste Verunreinigungen erfordern Reinigung / Desinfektion. So ist mindestens eine vierteljährliche Kontrolle auf Legionellen vorgeschrieben sowie der Nachweis der Wirksamkeit der eingesetzten Wirkstoffe gegen Legionellen gefordert.

Im Trinkwasser ist die Vergleichbarkeit von Analysenergebnissen für Legionellen gesichert und durch bundesweite Ringversuche nachgewiesen.

Eine mangelhafte Vergleichbarkeit der Analysenergebnisse von Legionellen in Kühlturmwässern stellt die Expertenkommission Legionellen [3] fest. Durch Teilnahmen an internen Vergleichsuntersuchungen von Legionellenbestimmungen an Kühltürmen in 2014 wurde unsere Untersuchungseinrichtung mit zum Teil erheblichen Unterschieden in den Analysenresultaten konfrontiert, trotz Einsatz normgerechter Analytik. Wenn die Frage, ob Legionellen auftreten oder nicht, nicht sicher und belastbar beantwortet werden kann, dann sind nicht nur diesbezügliche Entscheidungen mit einem hohen Risiko verbunden, sondern auch ein sicherer Nachweis der Wirksamkeit durchgeführter Legionellenbekämpfungsmaßnahmen in Frage gestellt. Aufgrund enger Grenzwerte ist es zwingend notwendig, eine sowohl vom Überwachten als auch vom Überwacher akzeptierte analytische Vorgehensweise zu etablieren, die vergleichbare Ergebnisse garantiert.

Die unerwarteten Unterschiede der Ergebnisse im Rahmen der Vergleichsuntersuchungen waren Anlass, mögliche Ursachen aufzuklären.

In Kühlturmwässern ist es umso notwendiger, die dort stärker auftretende Begleitflora zu eliminieren. Ist dies die Ursache für die ungenügende Vergleichbarkeit?

Um die Ursachen unterschiedlicher Analysenergebnisse aufzudecken, wurde ein Untersuchungsprogramm gestartet und mit dem statistischen Verfahren der Varianzanalyse ausgewertet. Ziel dabei war, die Frage zu beantworten, wie sich die Streuungsanteile der Verfahrensschritte Probenteilung, Probenvorbereitung und Analytik am Gesamtergebnis einordnen. Die Quantifizierung des Einflusses der verschiedenen Prozessschritte gestattet wichtige Hinweise auf die Verbesserung bzw. die Nutzung harmonisierter Untersuchungsverfahren für Kühltürme.

Untersuchungsmethode
Die Bestimmung von Legionellen in Wasserproben erfolgte nach den Vorgaben der ISO 11731 [4] und DIN EN ISO 11731-2 [5]. Dafür wurden der Direktansatz von 2 x 0,5 mL und die Membranfiltration von 100 mL der Probe durchgeführt. Die für den Nachweis von Legionellen verwendeten GVPC–Platten wurden mit der Oberseite nach unten 10 Tage bei (36 ± 2) °C inkubiert. Während der Inkubation wurden die Platten mehrmals auf das Wachstum kontrolliert. Die verdächtigen Legionellen – Kolonien wurden ausgezählt und einer Bestätigung unterzogen. Dabei wurde Fluoreszenz sowie das Wachstum auf einem cysteinfreien und cysteinhaltigen Nährmedium geprüft. Diejenigen Kolonien, die fluoreszieren, auf cysteinhaltigem Nährboden wachsen, nicht jedoch auf cysteinfreiem, wurden als Legionellen betrachtet.

Die Wasserproben aus den Kühltürmen weisen eine hohe Anzahl an Begleitkeimen auf, die das Wachstum von Legionellen maskieren oder sogar hemmen können. Es ist deshalb notwendig, eine Vorbehandlung der Proben durchzuführen. Die Vorbehandlung kann sowohl durch Erhitzen auf 50 °C für 30 min., als auch durch die Behandlung mit Säurepuffer erfolgen.

Bei der Planung der Untersuchung wurde versucht, die Einflüsse der Vorbehandlungsverfahren, der Nährmedien-Membranfilter-Kombination sowie des Filters im Gegensatz zum Direktansatz zu ermitteln, da alle genannten Schritte auf die Wiederfindung von Legionellen eine Auswirkung haben und somit die Vergleichbarkeit der Ergebnisse beeinflussen können.

Ergebnisse
Bei der Beprobung eines Kühlturms wurde die Gesamtprobe in 5 Laborproben geteilt und zur Untersuchung zur Verfügung gestellt. Jede dieser Laborproben wurde ein weiteres Mal geteilt. Eine Teilprobe wurde der Hitzebehandlung und die andere Teilprobe der Säurebehandlung unterzogen. Danach erfolgte eine Dreiteilung der Proben, deren Teilproben dann mittels Direktverfahren und zwei verschiedenen Filtertypen (A, B) jeweils doppelt analysiert wurden. Insgesamt wurden 60 Analysen durchgeführt. Das Untersuchungsschema ist in Bild 1, die Analysenergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Varianzanalyse
Die Varianzanalyse (ANOVA – analysis of variance) ist ein mathematisch-statistisches Verfahren zur Analyse quantitativer Messergebnisse([6] und [7]). Inhaltlich stellt die Varianzanalyse eine Verallgemeinerung des doppelten t-Tests zum Vergleich von Mittelwerten unabhängiger Stichproben aus normalverteilten Grundgesamtheiten dar. Mittels der Varianzanalyse lässt sich der Einfluss eines qualitativen Merkmals, auch als Faktor bezeichnet, auf ein quantitatives oder messbares Merkmal untersuchen.

Grundprinzip der Varianzanalyse ist die Streuungszerlegung der Gesamtstreuung in die Streuung innerhalb und zwischen den einzelnen Faktoren. Diese Streuungsanteile kann man ermitteln.

Man unterscheidet bei der Varianzanalyse zwischen dem Modell I mit festen und dem Modell II mit zufälligen Effekten. Im vorliegenden Fall sind die Effekte aller experimentellen Schritte, d.h. der Probennahme, der Hitze-/Säurebehandlung, des Direktansatzes oder Membranfiltration zufällig, so dass sich die weiteren Ausführungen ausschließlich auf das Modell II (Modell zufällige Effekte) beziehen. Je nach Versuchsanlage unterscheidet man weiterhin in die einfache, zweifache usw. Klassifikation der Varianzanalyse, in der Literatur oft auch als einfaktorielle, zweifaktorielle usw. Varianzanalyse bezeichnet. Nähere Einzelheiten zur Varianzanalyse sind hier nicht dargestellt und in der o. g. Literatur zu finden, eine ausführlich beschriebene Anwendung findet sich in [8].

Im vorliegenden Fall wurde die dreifache (dreifaktorielle) Varianzanalyse (ANOVA) benutzt, um den Einfluss auf die Analytik folgender Faktoren zu quantifizieren:
Faktor 1: Probennahme/Probenteilung
Faktor 2: Behandlung Hitze oder Säure
Faktor 3: Verfahren Direktansatz,
Filtration Filter A, Filtration Filter B

Ergebnisse der Varianzanalyse
Für die statistische Auswertung müssen die Merkmalsausprägungen metrische (rationale) Daten sein. Mit Ergebnisangaben wie „n. n.“ (nicht nachgewiesen) und „n. a.“ (nicht auswertbar) lassen sich keine Berechnungen durchführen. Man kann entweder den kompletten Datensatz löschen oder man benutzt sinnvolle Ersatzwerte (in Tabelle 1 farbig hinterlegt). So ist es üblich und wurde auch hier angewendet, bei „n.n.“ z. B. den Ersatzwert Null zu verwenden. Für die nicht auswertbaren Platten wurde als Ersatzwert die Hälfte des Messwertes der Doppelbestimmung verwendet. Die Verwendung des gleichen Wertes wie bei der Doppelbestimmung reduziert geringfügig die Analysenstreuung, ändert aber die Grundaussagen nicht und wird deshalb nicht dargestellt.

Im vorliegenden Untersuchungsfall stellt die Art der Behandlung (Säure / Hitze) den Haupteinfluss dar.

Der zweitgrößte Einfluss rührt von Verfahren (Direktansatz- oder Membranfiltrationsverfahren) her.

Für das untersuchte Kühlturmwasser stellt das Verfahren mit Hitzebehandlung und Direktansatz das Verfahren dar, welches angewendet werden sollte, um eine hohe Sicherheit zum Nachweis der Legionellen zu haben. Bei den anderen Verfahren ist der Fehler 2. Art, also vorhandene Legionellen nicht nachzuweisen, höher.

Die vorgestellten Ergebnisse basieren auf der in dem Kühlturm vorgefundenen
mikrobiellen Flora. Es ist denkbar, dass andere Zusammensetzungen der Mikroflora andere Verhältnisse ergeben. Dies kann mit dem hier beschriebenen Verfahren überprüft werden.

Fazit
Die Untersuchungsergebnisse auf Legionellen unter Berücksichtigung der möglichen Einflussfaktoren wurden mittels des Verfahrens der Varianzanalyse ausgewertet. Dadurch war die Quantifizierung der Einflüsse der Teilschritte Probennahme / Probenteilung, Hitze-, Säurebehandlung, Direktansatz/Membranfiltrationsverfahren auf die Legionellenanalytik möglich.

Für die Untersuchung der Wirkung weiterer, hier nicht betrachteter Faktoren wie z. B. an welcher Stelle im Kühlturm die Probennahmen erfolgen sollten, wäre der hier durchgeführte Untersuchungsumfang um diese Einflussgröße zu erweitern und neu zu untersuchen. Der Untersuchungsumfang einer solchen Varianzanalyse kann reduziert werden, wenn im Vorfeld das zu verwendende Laborverfahren festgelegt wird.

Schließlich zeigen die großen Einflüsse der Teilschritte Hitze-, Säurebehandlung und Direktansatz / Membranfiltrationsverfahren auf das Analysenergebnis, dass die verschiedenen Verfahren zur Eliminierung der Begleitflora die Ursache für die ungenügende Vergleichbarkeit der Untersuchungsergebnisse sind. Auch wenn sich die im Bild 2 dargestellten Ergebnisse der Varianzanalyse nur auf die hier untersuchte Mikroflora beziehen, sind sie ein guter Ansatzpunkt für die inzwischen zwingend notwendig erscheinende Überarbeitung der Untersuchungsvorschriften und der sich daran anschließenden Festlegung einer strikt einzuhaltenden einheitlichen Analytik durch den Gesetzgeber.

Zugehörigkeiten
1Wessling Gruppe, Standort Halle (Saale), Deutschland

Kontakt
Dr. rer. nat. Michael Winterstein
Technischer Leiter Beratung und Service
Bereich Statistik und Datenanalyse
WESSLING GmbH
Halle (Saale)
michael.winterstein@wessling.de

Literatur:

[1] Verordnung über die Qualität von Wasser für den menschlichen Gebrauch Trinkwasserverordnung –(TrinkwV 2001) TrinkwV in der gültigen Fassung vom 7.8.2014

[2] VDI 2047, Blatt 2, Januar 2015, Rückkühlwerke – Sicherstellung des hygienegerechten             Betriebs von Verdunstungsanalgen (VDI-Kühlturmregeln)

[3] Bericht der Expertenkommission Legionellen im Auftrag des Ministeriums für Klimaschutz, Umwelt, Landwirtschaft, Natur- und Verbraucherschutz des Landes Nordrhein-Westfalen, Stand 22.05.2015

[4] ISO 11731:1998-05, Water quality — Detection and enumeration of Legionella

[5] DIN EN ISO 11731-2:2008-06; Wasserbeschaffenheit- Nachweis und Zählung von Legionellen- Teil 2: Direktes Membranfiltrationsverfahren mit niedriger Bakterienzahl

[6] Lothar Sachs: Angewandte Statistik, 7. Auflage, Springer Berlin Heidelberg  612-688, (1992)

[7] K. Backhaus, B. Erichson, W. Plinke und R. Weiber: Multivariate Analysemethoden,11. Aufl., Springer Berlin Heidelberg  119-153, (2006)

[8] Winterstein M. und Einax J.W.: Bestimmung der erweiterten Unsicherheit der Probennahme inhomogener Brenn- und Einsatzstoffe (FKZ 390 01 024), Bericht Umweltbundesamt (2011)

 

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/search/gitsearch/Legionellen
VDI Blatt 2047: https://www.vdi.de/technik
ISO11731: http//bit.ly/ISO11731

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