Die Belastung von Böden mit Metallen und Metalloiden ist in der Landwirtschaft und auch bei anderen gewerblichen und privaten Nutzungen ein großes Problem. Ein Hauptsymptom dieser Belastung ist ein eingeschränktes Wachstum der Pflanzen, dies kann zu Engpässen bei der Nahrungsmittelproduktion führen. Außerdem besteht eine Gesundheitsgefährdung durch die akute und chronische Toxizität vieler Metalle. Ursachen für diese Belastung können beispielsweise falsche Düngung und Bewässerung, Ausbringen von Klärschlamm, Staub aus metallverarbeitenden Betrieben oder Industriemüll sein [1].

Es gibt natürliche Unterschiede in der Widerstandsfähigkeit einzelner Pflanzenarten gegenüber Metallen und Metalloiden. Pflanzen besitzen verschiedene Möglichkeiten wie sie auf eine derartige Kontamination reagieren können. Zu diesen Möglichkeiten zählen die Immobilisierung, der Ausschluss oder die Bildung eines Metall-Chelat-Komplexes [2]. Für diese Komplexierung bilden Pflanzen häufig Thiol-Peptide, die aufgrund ihrer Nukleophilie eine hohe Affinität für Metallionen besitzen. Eines der wichtigsten Thiol-Peptide ist das Glutathion (GSH), ein Tripeptid. Es besteht aus den drei Aminosäuren Glutaminsäure (Glu), Cystein (Cys) und Glycin (Gly). Das Glutathion ist selbst an Entgiftungsprozessen beteiligt, ist aber vor allem das Substrat für die Bildung von Phytochelatinen (allgemeine Formel (γ-Glu-Cys)_n-Gly (Abkürzung: PC_n n=2-11)). Die Synthese erfolgt mit Hilfe des Enzyms Phytochelatin Synthase. Das Enzym wird durch Metall-Ionen aktiviert, was zu einer Autoregulation der Biosynthese führt. Die Phytochelatine binden die Metalle und der Phytochelatin-Metall-Komplex wird in die Vakuolen transportiert, die ihn vom Metabolismus der Pflanze separieren (Abb.1).
Die wichtigste Anwendung der Phytochelatine liegt in der Phytoremediation, der Sanierung verunreinigter Böden und des Grundwassers durch den Einsatz von Pflanzen. Die Pflanzen akkumulieren die Metalle/Metalloide und andere Schadstoffe in den Vakuolen, wodurch sie hohe Konzentrationen aufnehmen können. Diese Technik wird als Phytoextraktion bezeichnet. Der große Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass vor allem die Funktion des Bodens erhalten bleibt.

Ein Schwerpunkt der Forschung liegt darauf, Pflanzen zu finden, die sowohl große Mengen an Schadstoffen aufnehmen können als auch schnell wachsen.
In dieser Arbeit sollen die Phytochelatine, welche sich bei einer Belastung der Wasserpflanze Hornkraut (Ceratophyllum demersum) mit Arsen und Cadmium bilden, untersucht werden. Das Ziel ist die Identifizierung der gebildeten Komplexe. Nach einer Trennung mittels HPLC erfolgt die elementselektive Detektion der Metalle mit Hilfe eines ICP-MS. Durch ein ESI-MS kann die Molmasse der freien Phytochelatine und der Phytochelatin-Metall-Komplexe ermittelt werden, woraus auf deren Zusammensetzung geschlossen werden kann. Ein weiterer Schwerpunkt ist die Untersuchung der Wechselwirkungen der zwei Metalle bei einer gleichzeitigen Kontamination. Zu klären ist, ob verschiedene Metalle gleichzeitig an ein Phytochelatin-Molekül gebunden werden können oder ob sie sich gegenseitig verdrängen.

Experimentelles

Probenvorbereitung
Die Zucht des Hornkrautes erfolgte in großen, künstlich beleuchteten Becken. Als Medium diente Wasser mit Hoagland's Nährlösung [3]. Die Kontaminationen erfolgten in kleineren Behältern mit dem entsprechenden Metallsalz (Cd(NO₃)₂, Na₂HAsO₄).
Nach der Entnahme wurden die Pflanzen zum Entfernen des anhaftenden Arsens kurz mit kaltem Wasser abgespült und das überschüssige Wasser mit Filterpapier entfernt. Die Pflanzen wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und mit Hilfe eines Mörsers zerkleinert. Die Extraktion wurde jeweils mit Ameisensäure (c = 0,2 mol/l) und Ammoniumformiat Lösung (c = 0,2 mol/l) durchgeführt. Pro Gramm Probe wurden 2 ml Extraktionsmittel verwendet. Die Extraktion erfolgte für 1,5 Stunden im Kühlschrank bei ca. 8°C. Im Anschluss wurde die Probe zentrifugiert (3 min bei 5.000 min^-1) und die überstehende Lösung mit einem Spritzenvorsatzfilter (0,45 μm) in Probeflaschen pipettiert.

Instrumentelles
Chromatographie: HPLC-Series 1100 (Agilent) mit Degasser und Autosampler; Detektion mittels ICP-MS (7500 ce, Agilent) und parallel mit ESI-MS (MSD 6130, Agilent).
Trennsäule: Atlantis C18, 5 μm, 4,6 x 150 mm (Waters)
Eluent: (A) saure Eluenten (pH = 2,7): Eluent A: 0,1% FA + 0,1% MeOH in Wasser; Eluent B: 0,1% FA + 20% MeOH in Wasser
(B) neutrale Eluenten (pH = 6,9): Eluent A: 0,1% NH₄COOH + 0,1% MeOH in Wasser; Eluent B: 0,1% NH₄COOH + 20% MeOH in Wasser

Ergebnisse und Diskussion

Kontamination mit Arsen
Arsen-Phytochelatin-Komplexe sind laut Literatur bei sauren pH-Werten stabil [4]. Es wurde eine Konzentration von 25 µmol/l für eine Dauer von fünf Tagen gewählt. In den aufgenommenen Chromatogrammen (Abb. 2) eluiert als Erstes ein GSH-As-Komplex (t_R = 2,08 min) zusammen mit freiem GSH. Es folgen die As-Komplexe mit PC₂ (t_R = 9,92 min) und PC₃ (t_R = 20,83 min), sowie ein Komplex mit zwei PC₂-Molekülen (t_R = 25,67 min). Außerdem konnte noch freies PC₂, sowohl in reduzierter (t_R = 9,92 min) als auch oxidierter Form(t_R = 11,52 min), detektiert werden. In der oxidierten Form bilden die beiden Thiol-Gruppen des Phytochelatins eine Disulfidbrücke. Diese Ergebnisse decken sich mit den Literaturangaben zu As-PC-Komplexen, laut denen Komplexe mit PC₂ dominieren, gefolgt von PC₃ [4]. Neben der Entgiftung durch die Phytochelatine erfolgt auch eine Entgiftung direkt durch das GSH.
Bei neutralen pH-Werten sollen die As-PC-Komplexe weniger stabil sein [4]. Um zu überprüfen, ob eine Analyse dennoch möglich ist, wurde Ammoniumformiat als Extraktionsmittel genutzt. Mit dieser Extraktionsmethode konnte nur eine As-Spezies, der As-GSH-Komplex (t_R = 2,12 min) detektiert werden. Die As-PC-Komplexe sind also bei einer Extraktion mit neutralem Extraktionsmittel instabil.